微生物方法学验证.docVIP

****** 微生物限度检验方法学验证资料 研究结构（盖章）：*****有限公司 研究负责人：（签名） 联系人：*** 联系人电话：***** 试验参加者：**** 试验起止日期：2011年11月2日～2011年11月20日 研究机构地址：北京****路6号 原始资料保存处：****有限公司 供样单位：*****有限公司 联系人：*** 联系电话：***** ****** 微生物限度检查方法 验证试验 1、目的 确认对供试品进行微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌和酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适用于该药品的微生物限度检查。 2、供试品 名称：******（规格：25/桶） 生产厂家：******有限公司 批号201110233、试验环境与器材 3.1测试环境条件 所有检测均在环境洁净度10000级洁净度的水平单向空气区域内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。 3.2仪器设备： YQS-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）、BI001200-II-A2生物安全柜（上海振梓创空气净化设备有限公司）、SPX-150型生化培养箱与GPX-9162电热恒温培养箱（扬州慧科电子设备有限公司）。 3.3培养基： 胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、MUG培养基等，以上培养基均由北京三药科技开发公司生产提供。 3.4菌种 大肠埃希菌（Escherichia coil）[CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003] 白色念珠菌(Candida albicans)[ATCC(F) 10231] 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均由中国医学菌种保藏中心提供，白色念珠菌由美国标准菌种收藏所提供，黑曲霉由中国药品生物制品检定所提供。 4、菌液制备与检验 4.1 取上述经35℃培养18～24h的金黄色葡萄菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释，金黄色葡萄菌至10-9、枯草芽孢杆菌10-6、大肠埃希菌10--7，约为50～100cfu/mL，备用。 4.2取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-6，约为50～100cfu/mL，做活菌计数备用。 4.3取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加4 mL0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，约为50～100cfu/mL，做活菌计数备用。上述各株菌的培养物均为第三代的培养物。 4.4菌液的检验 4.4.1取上述金黄色葡萄球菌10-9、枯草芽孢杆菌10-6、大肠埃希菌10-7的稀释液各1mL，分别用45℃营养琼脂培养基20 mL注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48h，计数，应约为50～100cfu/mL。 4.4.2取上述白色念珠菌10-6稀释液及上述黑曲霉10-5孢子悬液各1 mL，分别用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20 mL注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养，逐日观察计数，应约为50～100cfu/mL。 5、细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 照中国药典2010年版微生物限度检查法（中国药典2010年版一部附录XIIIC）中计数方法的验证方法进行试验。 供试液制备：取供试品10g，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL溶解，混匀，作为1：10的供试液。 5.1平皿法 5.1.1试验组：取供试液分别按1mL/皿后，加入上述50～100cfu的试验菌，立即倾注2010年版药典规定的琼脂培养基，置规定温度培养24～72h，逐日观察结果。 5.1.2菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数（同4.4菌液检验）。 5.1.3供试品对照组：除不加菌液外，同试验组测定方法，置规定温度培养24～72h，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。 5.1.4回收率的计算：按如下公式计算试验组的加菌回收率。 试验组的加菌回收率=试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数×100% 5.2培养基稀释法 5.2.1试验组：取供试液分别按0.5/皿、0.2/皿加入平皿后，加入上述50～100cfu的试验菌，立即倾注2010年版药典规定的琼脂培养基，置规定温度培养24～7