特异性T淋巴细胞增殖能力的HBV感染后的临床转归.pdfVIP

来临床诊断的发展方向已经广泛开展起来。细胞因子是参与体内错综复杂的免疫调节网络的重要 组分，多重检测能够避免不同时间点所产生的检测差异，从而更加准确地评估体内免疫状态，为 疾病的发病机制和治疗提供有价值的参考。另外一方面，通过平台解释相对变化比绝对定量必要 性更大。对于长期的病情观察和研究来说，细胞因子变化在纵向研究的相对变化上起了很重要的 作用。 特异性T淋巴细胞增殖能力与HBV感染后的临床转归 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院感染科 谢静刘佳文李雁凌宋晓碾李太生 B 乙型肝炎病毒(hepatitisvirus，I-IBV)感染呈世界性流行，全球约20亿人曾感染过HBV， 其中3．5亿人为慢性感染者。HBV也是我国面临的严重公共卫生挑战之一，现有慢性HBV感染 者约9300万人。人感染HBV后可出现不同的临床转归，包括急性感染后康复和病程慢性化， 而慢性感染者可能出现无症状携带、非活动性携带及慢性乙型肝炎甚至肝细胞肝癌等不同类型。 尽管目前乙型肝炎的发病机制尚未完全明确，但由于HBV并不能直接导致肝细胞病变，研究者 们普遍认为机体的病理损伤和病程转归主要与病毒入侵后引发的机体免疫应答有关，针对HBV 抗原的免疫应答在决定疾病转归方面发挥重要作用。 针对特异抗原的增殖能力是淋巴细胞功能的重要体现。在HBV的研究中，通过抗原刺激机体 T淋巴细胞增殖，从而评价感染者免疫应答强度的研究主要集中在用多克隆剂刺激总体T淋巴细 胞应答。已有研究通过抗CD3及抗CD28的抗体刺激，证实在慢性HBV感染者中T淋巴细胞的增 殖能力比健康人群弱。本研究通过流式细胞仪的技术，分别用乙肝表面抗原、核心抗原及核心抗 原肽段库作为特异性刺激原，利用CFSE染色的方法，比较HBV感染后康复者、携带者及慢性肝 炎患者之间的特异性T淋巴细胞的增殖，从而探讨慢性HBV感染的免疫学发病机制，并希望对进 一步研究慢性乙型肝炎的免疫治疗提供思路。 材料与方法 1．研究对象：33例HBV感染者来自北京协和医院肝炎门诊。根据2010年中华医学会肝病 学分会和中华医学会感染病学分会联合制订的慢性乙型肝炎防治指南》【5】，将33例HBV感 染者分为三组，分别包括：慢性乙型肝炎患者10例，携带者lO例(包括慢性HBV携带者8例， 非活动性HBsAg携带者2例)，HBV亚临床感染后康复者13例。在健康人群中招募志愿者， 选取接种过乙肝疫苗并产生免疫应答的健康人lO例及未接种过乙肝疫苗的健康人2例。所有受 试者均签署知情同意书。 bloodmononuclearcell，PBMC)的分离：肝素钠抗凝采血 2．外周血单个核细胞(peripheral 管收集外周静脉血20na／A，经密度梯度离心法分离出PBMC，冰浴上迅速将PBMC转移至细胞 ．142． 冻存液，放入．80℃冰箱中过夜，次日移入液氮罐中保存待用。 3．PBMC染色及培养：羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)(MolecularProbes公司) 溶于二甲基亚砜配制成5mM的储存液。液氮中冻存的PBMC复苏后，用PBS溶液重悬细胞， 分钟，用冷1640完全培养基终止反应，细胞洗涤两次后，用含10％热灭活胎牛血清的1640完 全培养基重悬细胞。将CFSE标记的PBMC加入48孔培养板，每孔l×106个细胞，分别加入 PHA(0．509lml)作为阳性对照、HIV-1p24抗原(1009／m1)作为阴性对照、重组乙肝表面抗 肽段库(209／m1)，同时以不加抗原的培养基为空白对照。培养体系中含rhIL．2(5U／ml，罗氏 公司)。细胞在37℃、5％C02培养箱培养7d。 对T细胞进行染色。校准流式细胞仪(FACSCant0，BD公司)的光路和液路，调整电压和荧光 补偿，每管读取细胞300000个，检测T细胞中CFSE荧光强度下降的细胞比例。以CFSE荧光 强度减弱一半以上的细胞为发生了增殖的细胞，以发生增殖的细胞的百分比来表示淋巴细胞的应 答情况。 WallisTest ANOVA或KnBkal 检验进行正态性和方差齐性检验，根据数据分布采用One--Wa