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中国试剂网 3.15.3.113 细菌总蛋白和膜蛋白提取方法 一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH 8.5-9.0 ）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl ，0.5% Triton X-100，调pH 值至8.5-9.0 备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的 蛋白酶抑制剂PMSF 。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g 湿菌体。 2 、将40ml 菌液在12000g，4 ℃下离心15 分钟收集菌体，沉淀用PBS 悬浮洗涤 2 遍，沉淀加入 1ml 裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s 超声/10s 间隔，超声20min ，反复冻融超声3 次 至菌液变清或者变色。 4 、1000g 离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE 电泳检测，或者用1% SDS 溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting 结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol 裂解液中分离总蛋白 1、Trizol 溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8 ℃下10000g 离心15min，上 层水相用于RNA 提取，体积约为总体积的60% 。 2 、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA 。每使用1ml Trizol 加入0.3ml 无水乙 醇混匀，室温放置3min，2-8 ℃不超过2000g 离心5min 。 3、将上清移至新的EP 管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol 加入1.5ml 异丙醇，室温放置10min，2-8 ℃下12000g 离心10min，弃上清。 4 、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol 加入2ml 洗液，室温放 置 20min ， 2-8 ℃下7500g 离心 5min，弃上清，重复洗涤2 次。最后加入2ml 无水乙醇，涡旋后室温放置20min ，2-8 ℃下7500g 离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS 溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解， 2-8 ℃下10000g 离心10min 去除不溶物。 6、替代方案：将3 中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8 ℃的1% SDS 溶液中透析3 次，1000g 离心10min 去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114 去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH 值至8.0 备用。 中国试剂网 3.15.3.113 2 、菌液于4 ℃条件下15000g 离心15min 收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的 PBS 洗涤3 次，最后于4 ℃条件下15000g 离心15min 收集菌体。 3、菌体沉淀加入1ml 冷提取液，于4 ℃条件下放置2h ，17000g 离心10min，去 除沉淀取上清。 4 、将上述上清中的Triton X-114 含量增加到2% ，再加入20mM 的CaCl2 抑制部 分蛋白酶活性，37℃条件下放置 10min 使其分层。室温下 1000g 离心 10min 使 液相和去污相充分分层。 5、将液相和去污相分开，分别用10 倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min 。 6、于4 ℃条件下17000g 离心30min，用去离子水洗涤沉淀3 次。 7、将沉淀溶解在1% SDS 溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提 取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。 8、SDS进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。