生物化学15.第十五章 基因工程与分子生物学常用技术.docVIP

幻灯片1 分子生物学技术现已广泛渗透到生命科学和医学等多个学科中，尤其推动了基因工程的发展。 对疾病的发病机制、诊断及药物生产等领域取得了令人瞩目的成就，对医学的发展起着巨大的推动作用。 幻灯片2 第一节 基因工程与基因重组 (Genetic Engineering and Genetic recombination) 一、基因工程的基本概念 不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。 将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。 幻灯片3 (一)工具酶 1.限制性核酸内切酶 (1) 能够切割DNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。 (2)命名 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 (3)识别特征 5′???GAATTC???3′ 3′???CTTAAG???5′ 限制性内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征。 幻灯片4 (4)切割位点 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况： ①产生3′ 突出粘性末端：以EcoRⅠ为例： 5′???G↓AATTC???3′ 5′???G AATTC???3′ 3′???CTTAA↑G???5′ 3′???CTTAA G???5′ ②产生5′ 突出粘性末端：以PstⅠ为例： 5′???CTGCA↓G???3′ 5′???CTGCA G???3′ 3′???G↑ACGTC???5′ 3′ ???G ACGTC???5′ ③产生平末端：NruⅠ为例： 5′???TCG↓CGA???3′ 5′???TCG CGA???3′ 3′???AGC↑GCT???5′ 3′???AGC GCT???5′ 幻灯片5 2.DNA聚合酶 (1)基因工程主要应用E.coli DNA聚合酶Ⅰ、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。 (2)主要用途： ①利用5/→3/聚合活性，合成DNA第二条链； ②对DNA的3/端进行填补或末端标记； ③E.coli DNA-polⅠ用于缺口平移，制作探针； ④T4 DNA聚合酶可用于DNA序列测定； ⑤Taq DNA聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)。 3.DNA连接酶 使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。 幻灯片6 4.逆转录酶 (1)用于真核mRNA逆转录，构建cDNA文库。 (2)用于进行3/端填补和标记，制备DNA探针。 (3)用于DNA序列测定。 5.多核苷酸激酶 (1)用于放射性标记DNA链的5/端。 (2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。 6.碱性磷酸酶 此酶防止载体的自身连接。 7.末端脱氧核苷酸转移酶 能催化单核苷酸转移到DNA的3/-端羟基上。 幻灯片7 (二)载体 1. 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。 能自主复制。 易进入宿主细胞。 具有多克隆位点。 易从宿主细胞中分离纯化。 有易被识别和筛选的标志。 2. 载体的选择标准 质粒 噬菌体 粘粒 病毒 3.常用载体 幻灯片8 (1)质粒(plasmid) ①质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。 ②通常质粒的大小为2～300kb。 ③一般只能容纳10kb的外源DNA片断。 幻灯片9 (2)噬菌体(bacteriophage，phage) ①噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。 ②噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 ③具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。 幻灯片10 (3)粘粒(cosmid) ①粘粒是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。 ②粘粒本身约4～ 6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。 (4)病毒 病毒载体更多地用于真核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。 幻灯片11 二、重组DNA技术的基本原理和过程 基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采