分子生物学实验PCR3薛美兰.pptVIP

目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR反应条件优化 PCR的类型和应用 PCR的基本原理 扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合 基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 94℃ 30″ 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。 2. 退火 (复性) (Annealling): 55 ℃ 30 ″ 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。 3. 延伸 (Extension): 72 ℃ 1′ 将反应温度调节到酶的最适温度，形成与模板链互补的新DNA链。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。 反应初期，原来的DNA担负起模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5 ′端之间的DNA片段。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl MgCl2: 1.5×30 / 25 = 1.8μl dNTPs: 0.2×30 / 10 = 0.6μl 引物 P1： 0.4×30 / 10 = 1.2μl 引物 P2： 0.4×30 / 10 = 1.2μl Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 1μl 水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl 操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 0.6μl×6 = 3.6μl 引物 P： 2.4μl ×6 = 14.4μl Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 21μl × 6 = 126μl 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。 2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪 94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。 PCR反应条件优化 1、温度、循环参数： ⑴ 变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。 ⑵ 复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 引物的长度在15 ～ 25 bp 之间时： 复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 一般情况下55 ℃