.分子生物学研究方法.ppt

* 分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1) 。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。研究表明这种发卡结构的探针在和目的片段杂交时的特异性很高,对于仅相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。由于分子信标是在样品PCR 过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR 产物,因此也用于PCR 产物产量的实时检测。 * DNA 聚合酶、APT 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和腺苷三磷酸双磷酸酶