双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究_临床医学论文.docVIP

双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究_临床医学论文 双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究_临床医学论文 【摘要】 目的：研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法：将双自杀基因载体pc电转染Y79细胞株。通过RT和 Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5向5的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5，25，50，100，200，400，800mg/L)和/或GCV(0，2，4，8，16，32，64mg/L),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果：双自杀基因载体pc电转染Y79细胞成功：在载体转染的Y79细胞中，RT扩增出长度为403bp的特异条带，Western blot检测见一59kD大小的条带，与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低：转染Y79细胞中，5向5转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低，两组比较当5浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(0.05)。转染组间比较，当5达200mg/L,GCV达16mg/L后，5组平均细胞存活率低于单加5或GCV组，有统计学差异(0.05)。结论：双自杀基因载体pc转染Y79细胞后，在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5和GCV达到一定浓度时，它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。 【关键词】 CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5 　　Abstract 　　 　　fered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC,GCV of different concentrations were determined by the method of MTT. 　　of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis,there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(0.05).The survival Y79 cells treated with 5FC and GCV was lower than 5FC or GCV. 　　DglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug. 　　 自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pc。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);