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哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义_临床医学论文 哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义_临床医学论文 作者：陈德忠, 付国昊, 朱述阳, 吕丽丽 赵传云 【摘要】 目的: 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织CCR3及EOS不同时相表达的变化, 探讨哮喘发病的可能机制。方法: 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型, 分为正常对照组（N）及哮喘组（A、 B、 C、 D、 E）, 每组8只, 于激发后30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死, 瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例, 免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3及CD34蛋白的表达; 制备豚鼠肺组织病理标本, 苏木精伊红染色, 免疫组化检测肺组织中CCR3和CD34的表达。结果: (1)哮喘组骨髓和外周CCR3与CD34及EOS表达明显增加; (2)OVA激发后, 骨髓和外周CCR3、 CD34及EOS表达: 30 min变化不明显（肺内CD34表达增加）, 6 h（肺内CD34表达下降）、 12 h达到峰值, 24 h开始下降, 48 h恢复正常水平; (3)骨髓的变化早于外周, CCR3的表达高峰早于CD34表达与EOS的增多高峰, 且CCR3、 CD34和EOS互呈线性相关（肺组织内除外）。结论: 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓CD34＋祖细胞、 EOS细胞到循环再到肺组织的通路, 骨髓和肺组织CCR3表达增强, 为CD34＋细胞、 EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。 【关键词】 支气管哮喘; CCR3; CD34; 骨髓; 豚鼠 哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、 肥大细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道炎症性疾患, 哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些细胞因子(如eotaxin, IL的诱导下分化成熟为EOS, 释放入外周血, 在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓循环气道, 存在着调控EOS及其祖细胞定向迁移的信号通路。趋化因子eotaxin对EOS有高度的特异性, 其受体3(CCR3)在EOS膜上大量存在, 且与eotaxin 有高度亲和性, eotaxin是强有力的EOS趋化剂, eotaxin和CCR3 在哮喘发病机制中起重要作用。本实验我们探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路; 通过研究CCR3及CD34的表达, 分析CCR3及CD34的改变对EOS在骨髓增殖分化及其在肺组织趋化和浸润的调节作用, 为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 雄性豚鼠48只, 体质量(250±50)g, 由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、 哮喘组(根据处死时间分为A、 B、 C、 D、 E组), 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 美国Sigma公司)、 CCR3、 CD34多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)、 奥林巴斯图像采集系统、 德国百瑞雾化器和自制雾化箱。 1.2 方法 1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1 mL (OVA 100 mg、 氢氧化铝200 mg), 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内, 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min, 连续5 d［1］。对照组于第1天腹腔注射1 mL生理盐水, 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min, 连续5 d。最后1次雾化吸入后, 哮喘组A、 B、 C、 D、 E分别于30 min, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h处死动物, 对照组12 h处死, 取材并作相应测定。 1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后, 断颈处死豚鼠, 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨, 去掉两端骨骺, 剖开骨干髓腔, 以含肝素1667 μkat/L的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出, 4℃, 1 000 r/min离心5 min后沉渣, 涂于多聚赖氨酸处理的玻片上, 干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min, -20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 随机计数200个白细胞, 并计算其中EOS百分比。 1.2.3 骨髓细胞CCR3、 CD34表达的检测 采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3、 CD34的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果, 胞膜为棕黄色者为阳性细胞, 在光镜(×400)下随机选取5个视野, 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例。 1.2.