实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用_临床医学论文.docVIP

实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用_临床医学论文 实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用_临床医学论文 作者：陈丽 李红海 鲁勇 李向阳 杨锦红 【摘要】 目的：建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR方法，用于细菌性阴道病的诊断。方法：按照Amsel诊断标准诊断细菌性阴道病；定性PCR检测患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌；实时荧光定量PCR测定患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌的DNA含量，同时测定标本中总的细菌16Sr RNA的DNA含量进行校正，即用阴道加德纳菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量比值来表示阴道加德纳菌的相对含量。用受试者工作曲线(ROC)评价对细菌性阴道病的诊断价值。结果：定性PCR的特异度为31.9%，敏感度为93.2%。实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌含量的线性范围1×10～1×105拷贝数/ml。阴道加德纳菌在细菌性阴道病中的相对含量为0.561 340 0，明显高于霉菌性阴道炎（0.01）、其他阴道炎(0.01)及健康体检者(0.01)，但与滴虫性阴道炎无明显差异（Pgt;0.05）。ROC曲线分析结果显示，曲线下面积（AUC）为0.909，当阴道加德纳菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量的截断值为0.102 603 5时，其诊断细菌性阴道病的总体敏感度和特异度分别为92.9%和80.3%。结论：实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法敏感度和特异度较高，准确性和重复性良好。对细菌性阴道病的诊断有一定的临床应用价值。 【关键词】 阴道加德纳菌 细菌性阴道病 实时荧光定量PCR 诊断价值 细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV) 是育龄期妇女常见疾病。在BV患者与健康妇女中,阴道加德纳菌( gardnerella vaginalis ,GV)检出率存在明显差异。在BV的微生物菌群中GV处于优势地位,数量明显高于其他非正常菌群[1]。目前对阴道加德纳菌的实验室诊断主要有直接涂片革兰染色找线索细胞、细菌分离培养、免疫荧光法以及PCR 等[2～4]。本实验建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR实验诊断方法，用于细菌性阴道病的快速诊断。 1 资料与方法 1.1 研究对象 2008年3月～2008年5月在本院妇科门诊就诊者141例,通过盐水湿片法对阴道分泌物进行检查，按照Amsel诊断标准[5]:①阴道pH值gt;4.5；②阴道分泌物增多、稀薄、有异味；③阴道分泌物加10%KOH可闻到鱼腥味；④涂片可见线索细胞。以上4项指标中3项阳性者判定为BV，共44例。滴虫性阴道炎12例，霉菌性阴道炎25例，其他阴道炎30例，健康体检者30名。患者（除外健康体检者）主诉有程度不同的阴道分泌物异常，外阴瘙痒，泌尿系症状及腰痛和下腹痛等症状，病程为3～10天,年龄23～50岁,均已婚未孕，就诊前3天无阴道灌洗和用药。月经期和绝经后妇女除外。 1.2 主要试剂与仪器 DNA聚合酶及其缓冲液、Mg2＋、dNTPs、RNA酶、PCR产物纯化试剂盒、SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物有限公司)，低温离心机，普通PCR仪（美国ABI公司 DNA Thermal cycler），琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器厂，DYCP－31D型），凝胶照像系统（上海复日科技公司），DU紫外分光光度仪（美国Beckman 公司），ABI7500PCR仪（美国ABI公司）。 1.3 引物设计与合成 阴道加德纳菌的引物合成参照文献[6],序列如下:上游引物：5′下游引物：5′；16Sr RNA的引物合成参照文献[7]，序列如下：上游引物：5′下游引物：5′，由上海生物有限公司合成。 1.4 模板制备 将溶于0.5ml无菌生理盐水的阴道分泌物，13000g/min离心30min,弃上清，加入400μl溶菌酶裂解液[5mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，8%蔗糖，10mg/ml溶菌酶]，置37℃水浴箱20min；加入500μg/ml RNA酶10μl，置37℃水浴箱10min；加入100μl 10%十二烷基硫酸钠，置37℃水浴箱30min；用饱和酚/氯仿/异戊醇抽提上层水相3次，经预冷无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温风干，最终溶解于20μl的TE缓冲液中，置-20℃保存备用。 1.5 PCR扩增 PCR反应体系为10×buffer2.5μl，dNTPs(各2.5 mmol/L)2μl，TAKARA Taq（5U/μl）0.125μl,MgCl2(25 mmol/L)1.5μl,上下游引物分别各为0.5μl（20μmol/L）,模板为3μl，用双蒸水补足至25μl（50μl体系为各种成分体积增加1倍）。PCR循环参数为：94