实验性偏头痛小鼠造模方法探讨_临床医学论文.docVIP

实验性偏头痛小鼠造模方法探讨_临床医学论文 实验性偏头痛小鼠造模方法探讨_临床医学论文 【关键词】 偏头痛 　　【摘要】 目的 摸索出皮下注射（sc）利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的sc利血平造模法。 方法 分别sc利血平0.7、0.4、0.15mg/（kg#12539;d），在4、6、9天断头取脑，用RP-HPLC荧光检测器检测脑内4种单胺类神经递质含量。 结果 0.7剂量组小鼠行为学几近无生命力，4种神经递质含量统计学上与空白组比较差异有显著性;0.4组6天有1值统计学无意义，9天组行为学与0.7组无异，而4天时行为学优于0.7组，RP-HPLC检测在统计学上有意义;0.15组行为、形态好，但RP-HPLC检测结果大多在统计学上无意义。 结论 根据本实验，建议用利血平注射液造模偏头痛小鼠模型时，采用0.4mg/kg造模4天。 　　关键词 偏头痛 动物模型 RP-HLPC荧光检测法 　　偏头痛是常见病、多发病之一，其发病机制至今尚未清楚。5-HT、儿茶酚胺（去甲肾上腺素及多巴胺）等神经递质早已被提出与偏头痛发作有关。偏头痛前驱期，大量释放的5-HT直接作用于脑膜血管上的5-HT受体，过度收缩脑膜血管;在头痛发作的前期，5-HT水平急剧下降，而尿中5-HT代谢产物增加，使脑膜血管扩张;给予5-HT释放剂芬氟拉明或利血平排空5-HT均能诱发偏头痛，这些事实都支持5-HT的功能紊乱与偏头痛的相关性。同时研究表明偏头痛患者中绝大多数症状可通过刺激多巴胺能系统而诱发，而多巴胺受体，尤其是多巴胺D2受体（DRD2）拮抗剂治疗偏头痛有效，多巴胺-β-羟化酶（D-β-OH）被认为是反应交感活性高低的指标，匡培根［1］ 及Callai等 ［2］ 研究发现，血清D-β-OH不论头痛期还是非头痛期均较对照低，但头痛发作期较间歇期增高。去甲肾上腺素（NA）在偏头痛发作前3h内升高，头痛时下降，血浆水平改变与5-HT相平行。 　　临床研究也发现，偏头痛患者外周血5-HT发病先兆期升高，发病高峰时降低，表明体内5-HT有一个由释放到消除的过程，这种5-HT含量的变化是偏头痛发作的主要直接原因，发现单胺类递质耗竭剂利血平能够诱发偏头痛。 　　本实验通过参考偏头痛的病因病机及文献资料的造模方法 ［3～5］ ，于实验中发现:皮下注射（sc）利血平剂量过大，小鼠容易死亡，行为变化太大，几近无生机;过小，则脑内神经递质含量变化在统计学上差异无显著性。此实验对利血平诱发偏头痛的动物模型进行了初步探讨，为摸索出sc利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的sc利血平造模剂量。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料仪器 高效液相色谱仪230型（美国），荧光检测器363型（美国），自动进样仪410型（美国）;色谱柱YWC-Pack ODS-A S-5μm12nm C18柱（250mm×4.6mm）;隔膜真空泵GM-0.33（天津市腾达过滤器件厂）;数控超声波清洗器KQ3200DB（江苏昆山市超声波仪器有限公司）;恒温磁力搅拌器JBZ-14型（上海志威电器有限公司）;pH酸度计PH201型（葡萄牙）;旋涡混合器XW-80A（上海精科实业有限公司）;超速冷冻离心机TGL-16G（上海安亭科学仪器厂）;电动玻璃匀浆机DY89-Ⅰ（宁波新芝科器研究所）。 　　1.2 试剂和药物 DA、NE、5-HT、5-HIAA均为Sigma产品;EDTA-2Na（上海国药集团化学试剂有限公司;NaAC（无锡犀牛化工有限公司;冰乙酸（杭州高晶精细化工有限公司;甲醇为优级纯（德国Merk）;水为用娃哈哈纯净水重蒸馏3次;利血平1mg/ml（上海复旦复华药业有限公司，030108）。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 造模及处理方法 KM雄性小鼠120只，18～22g，随机分为12组，每组10只:0.7mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;0.4mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;0.15mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;空白对照4天处死、6天处死、9天处死组;处死组连续按剂量分别sc利血平4天、6天、9天，后2h断头取脑，操作时须在冰台上进行，1min内取出全脑，用冰冷的生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，立即投入液氮中，固化后称重，每个脑组织大约加冰冷的0.4mol/ml高氯酸液700μl，在冰浴中用电动的玻璃匀浆器匀浆2min/个脑组织（固定转速和匀浆次数），将脑组织匀浆液转入Ependet离心管中涡流2min，置冷冻离心机（4℃）内以12000r/min离心20min。将离心后的上清液转入Ependet离心管