局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用_临床医学论文.docVIP

局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用_临床医学论文 局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用_临床医学论文 作者：李灵， 池闽辉， 曾金华， 许昌声， 刘景丰 【摘要】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平与细胞外信号调节激酶(ERK)活化在人门静脉高压症(PHT)脾静脉血管病变中的作用及可能机制。 方法 选取乙型肝炎感染后肝硬化PHT患者26例为PHT组;选取因外伤性脾破裂行脾切除术患者10例为对照组。放射免疫分析法(RIA)检测脾静脉中AngⅡ水平;免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测脾静脉中ERK的表达。 结果 PHT组脾静脉组织AngⅡ水平(248.91±48.31) ng/L，显著高于对照组(143.35±36.45) ng/L(0.01)。蛋白免疫印迹/免疫组织化学染色均显示PHT组脾静脉ERK表达较对照组明显增加。 结论 PHT时脾静脉组织AngⅡ水平升高，ERK表达增加。局部AngⅡ升高及ERK信号传导通路的激活可能与门静脉高压症的形成和维持有关。 【关键词】 高血压，门静脉; 脾静脉; 血管紧张素Ⅱ; 钙-钙调素依赖性蛋白激酶 近年研究发现门静脉高压症(portal hypertension，PHT)患者脾静脉局部血管紧张素原mRNA水平升高[1]，提示局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)激活可能在门静脉高压血管病变中起重要作用，但其机制仍不清楚。笔者通过检测脾静脉组织局部血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平、脾静脉组织中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白表达，探讨AngⅡ及ERK信号传导通路在门静脉高压症发生机制中的作用。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 PHT组脾静脉26例取自因乙型肝炎感染后肝硬化PHT脾功能亢进行脾切除+选择性贲门周围血管离断术患者，男性l6例，女性10例，年龄(45.1±10.2)岁(30~65岁)，肝功能均为Child B级。全组均无高血压病及糖尿病病史。对照组10例脾静脉取自因外伤性脾破裂而行脾切除的患者，年龄(44.3±9.8)岁(29~63岁)，均无肝炎、高血压病及糖尿病病史。每例脾脏切除后立即于脾门部无菌操作切取脾静脉，所取脾静脉分为2部分，一部分福尔马林固定，石蜡包埋，切片，行免疫组织化学检测;另一部分立即置于液氮中保存，行蛋白免疫印迹。 　　1.2 方法 　　1.2.1 放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)检测脾静脉组织中AngⅡ的含量 取150 mg血管组织放入匀浆管中，加入预冷的0.9%氯化钠溶液中(1 mL/100 mg)，冰浴匀浆，再将该匀浆液置于预冷的含EDTA二钠3.0 mmol/L、8-羟基喹啉3.4 mmol/L和二巯基丙醇3.2 mmol/L的试管中，煮沸10 min，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清液，测定采用 125I-AngⅡ标记的放射免疫分析，以SN-628B-3型放射免疫γ-计数器记录结果。 　　1.2.2 免疫组织化学法检测脾静脉组织中ERK的表达 切片脱蜡至水，加3% H2O2 5 min，PBS冲洗5 min，重复3次，加非特异性血清，室温30 min，弃上清加入1∶500 ERK抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)，37 ℃孵育1.5 h，PBS冲洗5 min，重复3次，加酶标二抗(即用型，北京中杉)，室温30 min，PBS冲洗5 min，重复3次，DAB显色，苏木素复染。计算机图像分析系统分析，光密度值表示ERK表达水平。 　　1.2.3 蛋白免疫印迹法检测ERK的表达 采用细胞裂解液进行脾静脉组织总蛋白提取及制备。蛋白样品经电泳，转膜，3%脱脂奶封闭30 min，加一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBS漂洗5 min，重复3次，加二抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，TBS漂洗5 min，重复3次，加鲁米诺，胶片上显影，显影信号的强弱用光密度分析，目标蛋白与β-actin(OD)比值表示蛋白表达相对量。 　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件处理，两组之间均数比较用t检验，0.05为差别有统计学意义。 　　2 结 果 　　2.1 PHT组与对照组脾静脉组织AngⅡ水平比较 PHT组AngⅡ为(248.91±48.31)ng·L-1，显著高于对照组(143.35±36.45) ng·L-1(0.01)。 　　2.2 PHT组与对照组脾静脉组织ERK表达比较 免疫组织化学检测脾静脉组织中ERK表达显示，PHT组表达