动物基因组DNA、总RNA测定.pptVIP

目的要求 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术； 了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点； 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。 理论基础 核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分； 按化学组成可以将核酸分成两大类： ① 含脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中； ② 含核糖核酸（RNA），主要存在于细胞质内； 在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。 1、RNA的提取与测定 RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。 常见方法（依据RNA的种类和来源）： ①苯酚法（实验室最常用的方法） ②去污剂法、③盐酸胍法， 苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱 和的水相中， DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。 优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。 RNA 提取 匀浆：称取3克牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右；　 离心：匀浆后溶液离心8000 r/min离心7分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取DNA； 除杂质：于上清液中加入等体积80％苯酚溶液，搅拌充分混合10-15分钟，置冰箱冷却静止10-15分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相； 沉淀RNA：取上层水相含RNA溶液，加入2倍体积95％冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却(约10-15分钟)，至出现白色絮状物—RNA，离心8000 r/min离心7分钟，取沉淀物； 溶解：用少量去离子水（约20毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。 RNA含量测定方法 测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚； 本实验用地衣酚测定 原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与3.5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10 ~ 100μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。 RNA 含量测定 试剂和器材 材料：牛肝 试剂： 0.14mol/L 氯化钠 标准RNA溶液：100μg/mL 地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂 （现用现配） 80％苯酚溶液 95％乙醇 器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等 DNA的提取及含量测定 在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA； 微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。 本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 去除蛋白的常用方法 变性剂法：用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA； 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品； 氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。 DNA的提取 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟； 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止； 沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀； 溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解。 DNA含量测定方法 二苯胺法： DNA分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。DNA在40 ~ 400微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。 除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应，其