牛泡沫病毒与相关病毒分子生物学研究.pdfVIP

牛泡沫病毒及相关病毒分子生物学研究 陈启民 天津微生物学会 (南开大学生命科学学院微生物学系分子生物学研究室天津300071) 茜暾‘ 、尹1995年前后，在北方养殖牛群中进行牛免疫缺陷病毒(Bovineimmunodeficiency 克隆测序证实，3026病毒是一株牛泡沫病毒(Bovine foamy (Bovinevirus foamy 代，而在Env编码区则是酸性氨基酸被取代，并导致两蛋白前体二级结构发生改变。． 一．牛反转录病毒相互关系的研究： 、 既然BIW伴随BIV出现，那么这两种病毒必定存在某种联系。于是对一些慢病毒像 途径。 =．BFV3026的生物学研究： 对病毒的体内感染进行初步探讨，发现BFV3026广泛存在于感染兔子的多种脏器中，可通过共培养 从感染兔子的血、肝、脾、肺、肾中拯救出相应感染性病毒颗粒，并在脑、骨髓、心、胰、肠系膜中检 到高拷贝BFV原病毒DNA存在。同时发现，感染兔子可持续产生高滴度抗病毒抗体，但不产生临床病变。 三．BFV3026的分子生物学研究： 1． 其感染性，通过对胎牛肺细胞的转染表明：所获克隆在转染细胞及其传代细胞中均能引发明显病变，导 致合胞体及病毒样颗粒产生。 因，发现并界定了内部启动子(internal 启动子的活性都依赖于反式激活因子Borf-i(即Tas)。并界定各启动子上的应答元件(Tasresponse 仅是牛泡沫病毒编码的反式激活因子，而且是一种序列特异性DNA结合蛋白，可直接结合LTR中的TRE” 所产生的应答效果也更强烈，并且更倾向于形成蛋白多聚体。这些特点均与泡沫病毒基因转录过程的时序 发现BFV 18 3．反式激活因子相关研究共转染实验表明，borfl基因产物为病毒唯一的转录调控蛋白。对Borfl 蛋白的进一步研究包括：通过生物信息学分析，获得有关Borfl蛋白分子进化、生化性质及转录后修饰 对BFVborfl基因转录本进行研究，通过对其不同 等有关数据，表明borfl的进化具有相对独立性： 3026的内部启动子近上游 观察到泡沫病毒时序调节中启动子的转换。结果支持时序模型。并发现在BFV 存在“神秘”转录起始点，该起始点在泡沫病毒的自然感染进程中发挥作用。在不同感染时间，borfl BorfI蛋白在原核细胞中的可溶性表 转录本拼接方式明显不同，暗示存在转录后调控。通过完成对BFV 达、并精细纯化到电泳级纯度。为利用结构生物学直观解析其作用机制打下基础：同时为抗体制备提供 优质抗原，获得高亲和性、高效价优质抗血清。用此抗血清研究发现Borf一1蛋白主要定位于细胞核，其 入核不是通过简单的被动扩散，而是需要细胞蛋白的辅助，定位相关序列位于羧基端167—249位氨基酸 之间。利用哺乳动物细胞双杂交系统，界定BFVBorfl蛋白激活域，发现Borfl激活作用存在以下特点： 其198—217位氨基酸为最小激活域。通过瞬时转染实验、激光共聚焦显微镜观察及免疫共沉淀试验，从 功能、定位及蛋白质相互作用等方面发现并证实Borfl的激活功能与细胞组蛋白乙酰化和去乙酰化信号 相关。推测Borfl激活基因表达的途径之一是通过募集细胞乙酰化酶至相应启动子周围，进而通过细胞 组蛋白乙酰化信号完成转录调节。 四．利用B吖3026构建基因转移载体相关基础分子生物学研究： 1．基因转移顺式作用元件以感染性DNA克隆为基础，构建系列缺失载体，并用绿色荧光蛋白表达 I、CASII)的存在。其中CASI位于BFV3026原病毒DNA5’非编 转移同时依赖两个顺式作用元件(CAS 码区1079—1515bp，CASll位于pol基因3’端4267--6644bp。 2．顺式作用元件与