皮肤分支杆菌感染PCR-RFLP检测方法地研究.pdfVIP

皮肤分支杆菌感染PCR-RFLP检测方法的研究 吴勤学 李晓杰 王洪生崔盘根刘训荃 中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所210042 摘要 目的：建立8种常见皮肤分支杆菌感染的PCR．RFLP检测方法。 内切酶BstEII和HaeIll对扩增产物进行消化，根据所得片段确定各分支杆菌特征性的酶切图谱，从 而对分支杆菌进行鉴别。 结果：8种常见皮肤分支杆菌感染标准株(鸟、胞内、堪萨斯、结核、瘰疬、海、偶然、龟分支 杆菌)的酶切图谱与文献报道一致。 结论：PCR-RFLP方法可用以检测鉴定皮肤分支杆菌感染。 关键词：分支杆菌结謦 专 细粤内 堪曳斯零痂 薏 唯然 导 、 。 聚合酶链反麻 限制性片段长度多态性分析 PCR和多重PCR方法，虽然快速、敏感、特异，但与探针杂交方法一样，有些分支杆菌目前尚 无满意的引物，在一定程度上限制了该方法在临床检测和鉴定中的应用，因此有必要建立其它方法 fragmentlength 需特殊的仪器设备，可为临床实验室作为常规鉴定之用。鉴于以上原因，我们采用以分支杆菌hsp65 基因为靶序列的PCR-RFLP方法，对已报道可引起皮肤感染的致病菌一鸟、胞内、堪萨斯、结核、瘰 疬、海、偶然、龟分支杆菌进行菌种鉴定，建立这些标准菌株的酶切图谱，为以后对临床分离株的 榆测和攀定打下基础。 材料与方法 ·、菌株来源及培养 标准菌株鸟分支杆菌(M．avium)、胞内分支杆菌(M．intracellUla re)、瘰疬分支杆菌 62． 上，根据其最适生长温度分别放于32℃和37℃培养。 二、RFLP所用主要试剂 限制性内切酶BstEII、限制性内切酶HaeIII购自MBI公司 三、PCR扩增分支杆菌的热休克蛋白基因(hsp65) (一)DNA模板的制备 收集丰富生长的细菌，无菌操作，加适量无菌蒸馏水，用组织研磨器研磨，制成细菌悬液；取 少量细菌悬液涂片、抗酸染色后计数，计算出浓度。采用冻融法提取细菌DNA，即液氮冷冻1min， 沸水煮沸tmin，反复5次。其中最后1次煮沸IOmin，离心后取上清，．20(2保存备用。 (二)PCR反应体系 10×TaqDNA聚合酶反应缓冲液’ 、 5 uL dNTP(10mM／emh) 1 uL TaqDNA聚合酶 lU 上游(5‘)引物 l HL(50pmoi) 下游(3’)引物 l HL(50pm01) 模板DNA 撕laL。 加灭菌DW至 50pL。1 AACGATGGTGTGTCC 引物为分支杆菌的通用引物：上游：5-ACC AT．3- 下游：5-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’ 1 PCR循环条件：预变性94℃5min，然后94*(2min，60CI rain，72(21 rain，共45个循环后末 次延伸72℃10min。 四、RFLP法检测8种分支杆菌标准株