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研究论文 虎流感病毒HA和NA基因分析与分子进化地位研究 高玉伟1夏成柱1扈荣良1王立刚2刘丹2邹啸环3黄耕1贺文琦1孙贺庭1 (1。军需大学军事兽医研究所长春130062；2．黑龙江瘩东北虎珠园。 哈尔滨，150027；3．军需大学中心实验室，长春130062) A型流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的成员。在病毒粒子的囊膜表面镶嵌着两种重要的纤突蛋 型和9个NA亚型。HA和NA与病毒的致病力、传播和宿主特异性关系十分密切。HA在病毒吸附及穿膜 过程中起关键的作用。它刺激机体所产生的中和抗体可中和病毒的感染。HA在感染过程中可从裂解位点 处被水解成两条肢链：HAl和HA2，这是病毒感染细胞的先决条件，裂解位点处碱性氮基酸的数量可决定病 毒的毒力。NA是Iv表面的另一种重要抗原，它可以水解细胞表面受体特异性糖蛋白未端的的N一乙酰基 神经氨酸。病毒在细胞表面成熟时，NA可移去细胞膜出芽点上的神经氨酸，有利于病毒的成熟和释放。它 诱发的抗体可以抑制神经氨酸酶的活性，并具有免疫保护作用。 2002年，夏成柱等从表现高热、拒食和间有抽搐症状的发病虎中分离获得2株TIV，为进一步查明这两 株病毒的分子来源、近化地位和其致病力的分子基础，我们对HA与NA基因进行序列测定与分析I现报告 如下： 1材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒株 HAB／01和SX／02病毒株的FSI细胞培养物，按常规方法传代培养。 I．1，2菌株与载体 18一T E．eoli Vector载体购自大连宝生物工程有限公司。 DI-Ba感受态细胞由本室保存、pMD I．1．3主要试剂 DNA 总RNA提取试剂盒，Taq plus Marker(DL2000)购自大连宝生 Promega公司或上海生工；引物合成由上海生工进行；AMV逆转录酶，DNA 物工程有限公司；小量DNA凝胶回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司； I．1．4主要仪器 PCR 2700 2K15冷冻熹速离心机，Biofuge SystemPCR仪，Sigma p沁(Hemlls)台式高速离心 GeneAmp 机，Bio—Bad3000xi电泳仪，UVI凝胶自动成像系统，Hm-ds MCO 一17AI细胞培养箱。 1．1．5引物 读码框的特异性引物，引物由上海生工合成。序列如下： HAPF：5’一AAAATGGAGAGAATAGTGCTT一3’ HAPR：5’一CTACAATCTGAACTCACAAAT一3’ NAPF：5’一GCAAAAGCAGCAGATTAAAATG一3’ NAPR：5’一GAACAAACTACTTGTCAATGG一3’ 一58— ⑩2003学术年会 1．2方法 1．2．1RNA提取和逆转录 Buffer RNA的提取参照说明书进行。将提取的总RNA溶于19．5出反转录体系(AMV4pl，2． 5mMdNTP dT 3va，50pmoL／tholigo RNasin2以，H20 AMV反转录酶(2．5u)，42E作用2h，一20℃冻存备用。 8．5出)中，加O．5va 1．2．2 PCR扩增 后，72。C延伸7分钟。扩增结束后，取5—8ul用0．8％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。 1．2．3克隆及测序 用小量DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，0．8％琼脂糖凝胶电泳检查回收