分子生物学重组质粒的制备.docVIP

PAGE 2 PAGE 6 实验一 感受态细胞的制备 一、实验材料 大肠杆菌DH5a 、LB培养基、0.1M CaCl2,50ml大Ep管，冰，80%甘油。 二、操作步骤 氯化钙法 将单个菌落或液体菌种（1:50）接种于20mL LB培养液的试管中，37℃振荡（200r/min） 取过夜2ml菌体加入100mLLB培养液37℃振荡培养至光密度（OD600）值在0.4-0.5之间。（约需1h-2h） 预冷0.1M CaCl2，和2个50ml大Ep管。 将细菌培养物分别倒入预先冰浴的无菌50mL大Ep管中，冰浴30min. 于4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜，放于冰浴中。 加10mL冰冷的0.1mol/L MgCl2溶液混匀，冰浴30min。 4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜（吸尽），放于冰浴中 加入2ml 0.1 mol/L CaCl2轻混。 分装于1.5ml离心管中，(每支200uL)，－80℃ 1)转化用：200ul/Ep 2）保存：180ul+20ul甘油（80%） 注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。 2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在－80℃几小时后感受性达到最高值 实验二 质粒DNA的小量提取 一、试剂及溶液 LB培养基、葡萄糖 用于碱法提取质粒DNA的溶液 10MNaOH (少配置) 10% SDS 0.5M EDTA (pH8.0)50ml 1MTris-HCl (pH8.0)50ml 5M的Kac50ml NaOH 200g SDS 5g Na2EDTA*2H2O 9.3g TrisBase121.14g CH3COOK245.35g H2O 50ml H2O H2O 25ml(NaOH调pH) H2O 800mlHCl调pH(先浓后稀) H2O 400ml Total 200ml Total 100ml Tatoal 50ml Tatoal 1000ml Tatoal 500ml a.溶液Ⅰ（GET）缓冲液(50ml)：葡萄糖0.49g，0.5M的EDTA(pH8.0)1ml，1M的Tris-HCl(pH8.0)1.25ml。 b. 溶液Ⅱ（变性液）：(现用现配) 1.5ml 2ml 4.5ml 8ml ddH2O 1.32ml 1.76ml 3.96ml 7.04ml 10MNaOH 30ml 40ml 90ml 160m 10% SDS 150ml 200ml 450ml l800ml c. 溶液Ⅲ（醋酸钾溶液）（50ml）[气味较大，最好在通风厨中配置]： 60mL的5M的KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O. PH4.8 (2)缓冲液 TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，5M EDTA（Ph8.0）40ml，用H2O定容到1000mL。高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍后作为工作液使用，5Χ比较稳定。 TE缓冲液（1ml）：1M Tris-HCl 10ul，0.2M EDTA pH8.0(2ul), ddH2O983ul其中含有RNase20μg/ml(可以不加)补足ddH2O。 (3)LB培养基（液体LB中不加琼脂） 500ml 300ml 200ml 100ml 胰化蛋白胨 5g 3g 2g 1g 　　 酵母提取物 2.5g 1.5g 1g 0.5g 　　 NaCl 5g 3g 2g 1g Agar 7.5 g 4.5g 3g 用10MNaOH调pH至7.4，定容后高压灭菌20min。 (4)其他试剂 苯酚/氯仿/异戊醇 (25 : 24 : 1)、 氯仿/异戊醇（24 : 1）棕色玻璃瓶中4℃保存过夜，在通风厨中配制。 异丙醇,70%乙醇 二、质粒DNA的提取操作步骤 培养细菌：将带有质粒的单菌落（液体菌种），接种到LB液体培养基中（加抗生素），37oC震荡培养8h-16h，一般过夜培养。 取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心5min,去掉上清夜,加入1.5