大肠杆菌的检测及原理.docVIP

大肠杆菌的检测及原理 1.检测原理： 大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 2.仪器设备与器具： 2.1 恒温培养箱：36±1。 2.2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。 2.3 接种针。 2.4 显微镜。 2.5 超净工作台。 2.6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。 2.7 天平：感量0.01g。 2.8 灭菌釜。 2.9 培养皿（直径为90mm）、试管，经121、30分钟灭菌。 2.10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片 3.培养基及试剂： 3.1 乳糖胆盐发酵管：按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。 3.2 伊红美兰琼脂平板： 按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。 3.3 乳糖发酵管： 按照制造厂家使用说明进行配制，灭菌。 3.4 革兰氏染色液。 3.4.1 结晶紫染色液： 结晶紫 1g 95%乙醇 20ml 1%草酸铵水溶液 80ml 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 3.4.2 革兰氏碘液： 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 ml。 3.4.3 沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95%乙醇 10ml 蒸馏水 90ml 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 3.5 生理盐水。 4.检验程序： 检样 稀释 ↓ 乳糖胆盐发酵管，36±1，24±2hr ↓ 不产气 产气 ↓ 大肠菌群阴性 伊红美兰琼脂平板，36±1，24±2hr 报告 ↓ ↓ 革兰氏染色 乳糖发酵管，36±1，24±2hr ↓ ↓ ↓ G+ G-，无芽孢杆菌 产气 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阴性 报告 大肠菌群阳性 报告 5.测定方法： 5.1 检样稀释： 5.1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。 5.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的 试管中，振摇成1：100稀释液。 5.1.3 重复5.1.2的操作，使成1：1000稀释液。 5.2乳糖胆盐发酵试验：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择二个稀释度，每一稀释度接种3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管。1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。然后置于36±1 培 养箱内，培养24±2hr，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌 群阴性；如有产气者，则可按以下程序进行。 5.3分离培养：将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上，置36±1温箱内，培养24hr后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色。 5.4证实试验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管，置于36±1温箱内培养24±2hr，观察产气情况。乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5.5报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。