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实践操作技能题库-实验室 一、细菌革兰氏染色（50分） 操作要点： （一）能够制作生理盐水涂片与固定（10分） （二）能够对初染、媒染、脱色、复染四个步骤正确操作（20分） （三）能够熟练使用显微镜和观察细菌形态，着重评估其染色效果。（20分） 二、沙门菌增菌与分离培养（50分） 操作要点： （一）对沙门菌的实验室检测的基本方法与流程、样本处理与所用试剂有一定了解。（10分） （二）能够正确处理粪便样本与增菌操作（20分） （三）能够正确使用沙门科玛嘉平板进行划线分离与培养，能够分离单菌落与识别沙门菌菌落形态。（20分） 三、志贺氏菌血清学凝集试验（50分） 操作要点： （一）对志贺菌的基本血清型别与玻片凝集实验有一定了解。（10分） （二）能够正确使用分型血清进行玻片凝集操作（20分） （三）能够准确判定凝集现象和判定志贺菌血清型别（20分） 四、霍乱弧菌增菌与分离培养（50分） （一）对霍乱弧菌的实验室检测的基本方法与流程、样本处理与所用试剂有一定了解。（10分） （二）能够正确处理粪便样本与增菌操作（20分） （三）能够正确使用四号琼脂/TCBS琼脂进行划线分离与培养，能够分离单菌落与识别霍乱弧菌菌落形态。（20分） 五、沙门菌药物敏感性测试（纸片法）（50分） （一）对细菌药物敏感性实验的基本方法与流程、样本处理与所用试剂有一定了解。（10分） （二）能够正确制备菌悬液与涂布MH平板（15分） （三）能够正确装载药敏纸片和使用纸片分配器压盖平板（15分） （四）能够正确测量抑菌圈直径和判定结果（10分） 六、请回答实验室检测布氏杆菌的方法，并对下列血清标本进行布病病原检测（50分）。 答：有两种：虎红平板试验可以对布病进行初筛，适用于大样本量检测，试管凝集法1:100（++）以上可以对布病进行确诊（10分）。 虎红平板试验（共15分）：实验前先将虎红试剂摇匀（2分），准备玻璃平板一块，取虎红试剂30ul，待检血清30ul，枪头混匀，5min内观察有无凝集现象。要求操作者对标本检测结果进行判别（13分）。 试管凝集试验（25分）：取硬玻璃管3-4个，对血清分别进行1:25、1:50、1:100、1:200稀释，每管中加入等体积的布病抗原，摇匀，放入37°C温箱中放置18-24h，观察试管凝集现象及清澈度，对结果进行判定。 七、请对下列标本进行乙脑IgM的检测（50分）。 答：（一）首先将乙脑试剂盒取出室温平衡30分钟；将洗液按照说明书进行配制（5分） （二）血清标本进行1:100稀释（5分），脑脊液标本1:10稀释（5分）。 （三）取出试剂盒中酶联管，设置空白对照、阴性对照、阳性对照，进行标记。加入标本50ul，空白对照不加，阴性对照和阳性对照各50ul入相应标记孔，用膜封板，37°C温箱放置1h。（15分） （四）洗板4次，甩干！在各孔中加入酶标抗原50ul，用膜封板，37°C温箱放置1h。（10分） （五）洗板4次，甩干！在孔中分别加入显色液A和B各50ul，用膜封板，37°C温箱放置15min，加入终止液，15min内判读结果。（10分） 八、请对下列手足口病标本进行病原检测（50分）。 答：（一）标本处理过程（15分）： 1.粪便标本处理（10分）：请操作者说出需要准备哪些耗材和试剂（氯仿、完全PBS、1.5mlEP管，玻璃珠，电动加样器，加样枪，不同规格的tip头，离心机）。取1.5mlEP管一个，完全PBS 0.9ml和氯仿0.1ml，放入3-5个玻璃珠，取绿豆大小粪便放入EP管，振荡器剧烈震荡30S，6000rpm/min离心15min，取上清备用，进行提取病毒RNA。 2.咽拭子标本处理（5分）：首先将咽拭子标本剧烈震荡20min，3500rpm/min离心15min钟，取上清备用，进行提取RNA。 （二）核酸提取（5分）：给操作者提供病毒RNA提取试剂盒，请操作者针对说明书，对操作步骤进行叙述。 （三）RT-PCR配制：提供EV71荧光RT-PCR试剂盒，请操作者配制EV71 RT-PCR体系（10分），并对荧光RT-PCR仪器进行程序和模板设置（程序设置5分，模板设置5分）。 （四）判读结果（10分）：调出日常手足口病双通道试剂盒检测结果，请操作者进行操作，对结果进行判读。 九、请对下列禽流感标本进行病原检测（50分）。 答：（一）禽流感标本前处理（10分）：对棉签进行挤压，或震荡器剧烈震荡20分，离心机15min，取上清进行核酸提取。 （二）核酸提取（10分）：给操作者提供病毒RNA提取试剂盒，请操作者针对说明书，对操作步骤进行叙述。 （三）RT-PCR配制（20分）：提供EV71荧光RT-PCR试剂盒，请操作者配制EV71 RT-PCR体系（10分），并对荧光RT-PCR仪器进行程序和模板设置（程