实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定.docVIP

实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液； 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]； 标准曲线制作： 管 号 1 2 3 4 5 6 7 试剂（ml） 亚硝酸钠标准液 蒸馏水 1%磺胺 0.02%萘基乙烯胺 每管含亚硝态氮（ug） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 样品中硝酸还原酶活力测定 在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。 比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm 空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。 结果计算 单位鲜重样品中硝酸还原酶活性 [μg/ (g .h)] 式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。 二、谷氨酰胺合成酶的活性的测定 【原理】 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mm