禽流感病毒核蛋白基因的克隆与其在大肠杆菌中的表达研究.pdfVIP

主旦堂篁塑堂叁量匿塑垒塑童业委员会2003年学术年会 ·159· for the and groudw。。k structurefunction，and researching datafor provided vaccine e“gineeri“g development． cholera Keywords：hoglapinisedvirus，E29ene，CHO(dhfr--)，EGFP 禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究+ 胡思顺，李自力，肖运才，石德时，许青荣，程峰，毕丁仁” (华中农业大学畜牧兽医学院，湖北武汉430070) L摘要]本研究根据禽流感病毒核蛋白基因序列，设计合成一对引物，采用RTPCR法成功地 AIV的NP基因比较，同源性达97％以上；与不同亚型比较，同源性达92％左右，说明该基因具有 BL2lcodon blotting鉴定分析，融合表达蛋白GST NP大小约为84KDa，约占菌体总蛋白的18％，能与鸡抗 AIV抗体发生明显的抗原抗体反应。AIV--NP基因的克隆和表达，为开发新型广谱基因工程疫苗 和临床快速诊断试剂的研制奠定了基础。 [关键词]禽流感病毒；核蛋白；GST；原核表达 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类的烈性病毒性传染病。1878年在意大利首次发现，现已遍布世界 AIV的发病及流行情况，并对分离的病毒株(HB株)进行了初步鉴定，证实亦为H9N2亚型。 生特异性抗体，对攻毒具有一定保护力，同时也有良好的种间交叉反应性，不受AIV亚型的影响口][…。这为 研制新型广谱的AI疫苗提供了可能，也为AI早期快速诊断试剂的开发奠定了基础。因此，我们开展了AIV —NP基因的克隆与表达研究。现将结果报告如下。 1材料和方法 1．1病毒的增殖、收获及纯化AIV 弃24小时前死胚，收集24～96小时的鸡胚尿囊液；4。C 1，2菌种、质粒与试剂大肠杆菌DHSa、BL21eodon (P1)：5’AGGGTACCTAATCACTCACTGA +基金项目：湖北省科技厅重点项目(20002P0805) 作者简介：胡思顺，男，27岁，动物医学院博士研究生武汉430070 Fa **通迅作者，Tel．02787280208 Email：Bidingren@mail．hzau．edu．cn 。1 of 60‘ProceedingsSymposium VeterinaryMicroorganismBranch,Chinese A—ssociation GTCGTACTCCTC3’。P1在启动子之外，另加入有Kpn I酶切位点，P2包含有终止密码子，并加入了 EcoR I位点。两引物之间包含有NP基因完整的阅读框架(ORF)。 试剂中混匀，加0．2ml氯仿剧烈震荡均匀，然后冰浴10min。在室温条件下10，000rpm离心15min后取上清 水。 1．5 RT--PCR按照RT--PCR试剂盒说明进行RT C C90 PCR。反应条件为：94℃45秒，5145秒，72 收试剂盒回收扩增的特异产物，用于克隆。 1．6 NP基因的克隆将回收的扩增片段按T载体系统的操作说明直接克隆于T载体中，用CaCl2法转