体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究.pdfVIP

遗传育种 2011年 第47卷 第3期 体外重组神经氨酸酶的表达 及其亚细胞定位研究 1,2 1 1 1 任丽伟 ，丁爱军 ，傅德智 ，李碧春 （1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009； 2.山西省河津市第二中学，山西河津 043300） 研究神经氨酸酶 （NA）基因在体外培养 NIH-3T3细胞中的表达定位。实验构建了真核表达载体 pcDNA3.0/EGFP-NA与pcDNA3.0-NA，采用聚乙烯亚胺介导基因转染法，分别转染NIH-3T3细胞，转染48h 后在荧光倒置显微镜下观察，并分别用RT-PCR与间接免疫荧光 （IFA）进一步检测。结果表明：成功构建了 EGFP-NA融合蛋白的表达载体；RT-PCR检测到EGFP-NA融合蛋白的表达；NIH-3T3细胞EGFP标记观察 显示绿色荧光分布在胞质近胞膜，细胞核内无绿色荧光；间接免疫荧光鉴定显示，绿色荧光分布在细胞膜内外，表 达的重组NA蛋白定位在细胞膜上。 绿色荧光蛋白；NIH-3T3细胞；重组质粒 S852.65 B 0258-7033201103-0014-05 神经氨酸酶（NA）是构成禽流感病毒纤突的一 pcDNA3.0/EGFP-NA分别转染 NIH-3T3细胞，采用 种重要蛋白成分，是一种糖苷外切酶，具有酶切活 间接免疫荧光法与融合蛋白表达2种方式对 基 性。NA可发挥双重功能，一方面在A、B型流感病毒 因在细胞个体水平上的表达进行精确定位，为深入 的复制与扩散中具有重要作用，可以从 α-糖苷键 研究 蛋白的抗病功能奠定基础。 上除去唾液酸和从病毒感染的细胞上除去唾液酸残 基，主要表现在协助病毒粒子进入细胞和子代病毒 [1-2] 1.1 实验材料 DH5 菌株、质粒pEGFP-N1、 从表面释放，防止病毒粒子聚集 ；另一方面它可 以酶切去掉容易感染禽流感或新城疫等粘病毒的细 NIH-3T3细胞株由实验室保存；重组质粒pcDNA3.0-NA 胞表面的唾液酸受体，使细胞免受禽流感病毒等粘 由本研究构建与保存，鸡NA蛋白多抗血清由实验 病毒的感染，也正是这一功能让 NA成为抗禽流感 室自制。 1.2 主要试剂 LA DNA聚合酶、 DNA聚 研究中的热点，同时也为家禽抗病育种研究提供了 合酶、 Ⅲ、 Ⅰ限制性内切酶、T4DNALig- 很好的素材。NA生物学功能的发挥与细胞定位密 切相关。基因表达定位研究多数要依赖报告基因来 ase、胶回收试剂盒（TaKaRaAgroseGelDNApurifica- 定位。近年来，绿色荧光蛋白（ ）基因，特别是增 tionkit）、1kbDNAMarker均购自（大连）TaK