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陆川猪克隆胚胎移植的探索与研究 肖正中周晓情何若钢卢晟盛张家富刘桂武 (广西大学动物科学技术学院，南宁530005) 【摘要】：胚胎移植包括胚胎的实验室培养和胚胎的植入手术两大部分。在胚胎移植技术中除了 要在实验室获得高质量的胚胎外，同时还要有效的把胚胎植入受体。本文就本人长久来进行胚胎移 植经验以及在试验过程中遇到的问题与大家交流和探讨。 【关键词】：陆川猪；胚胎移植；移植技术；胚胎植入 中图分类号：Q954．4 胚胎移植是猪克隆技术成功的一个关键技术。在实验室培育出高品质的胚胎后，最重要的一部 就是将胚胎植入受体猪体内。由于在实验室胚胎发育的条件是可以通过人工精确控制的，而一但胚 胎移入猪体内后胚胎的环境便是很难进行控制。所以胚胎植入手术对整个试验的成功显得也非常重 要。本文将从实验室胚胎的培养、受体猪的选择、胚胎植入手术、手术后护理等几个方面来讲述整 个胚胎植入的过程。 1、克隆胚胎的培养 1．1药品及溶液的配置 ①DMEM培养液：DMEM基础液添加0．11g／L丙酮酸钠，66mg／L青霉素和100mg／L的硫酸链霉 素，调节pH至7．2—7．4，使用前添加15％的FBS，1％非必需氨基酸NEAA构成细胞完全培养基。 ②胰蛋白酶消化液为0．25％胰酶+0．02％EDTA。 p,g／ml 青霉素，50“g／ml链霉素。 ④洗卵液为改良TL-Hepes-PVA液。 黄体素LH、3．05mmol／LD一葡萄糖、0．91mmol／L丙酮酸钠、0．57mmol／L半胱氨酸、10 ng／ml表 lI p 皮生长因子、75 g／m1青霉素、50g／ml链霉素。) ⑥显微操作液为添加10％FBS和7．5I．tg／ml细胞松弛素B(CB)的洗卵液。 ⑦融合／激活液为O．25M甘露醇+O．1mmol／LCaCl2+0．1姗ol／mLMgS04+0．5mmol／L Hepes+O．01％PVA。 1．2猪克隆胚的生产 1．2．1猪卵母细胞的收集和体外成熟 猪卵巢是从屠宰场收集后，置于30一37℃的O．996生理盐水中5小时内运回实验室，并用生理盐水 冲洗3—5次。取选取卵巢表面上直径2—6mm的卵泡，用带12号针头的10毫升注射器抽取卵母细胞。在 实体显微镜下选择带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞(COCS)。用玻璃吸管吸取后，在洗 卵液中洗3次，再在成熟液中洗2次。然后将卵母细胞移入事先在培养箱中平衡4h以上的成熟液滴中， 用胚胎级矿物油将其覆盖，培养24h(培养箱条件：5％C02的空气、最大相对饱和湿度、39℃)。 然后转移到无FSH和LH的成熟液滴中继续培养18-20h。然后用O．1％透明质酸酶除去卵丘细胞，挑选 排出第一极体的卵母细胞待用。 1．2．2供体细胞准备 取刚刚产下的广西巴马小型猪的睾丸和普通猪胎儿用含66mg／L青霉素和100mg／L的硫酸链霉 素的DPBS和75％酒精清洗各3-5遍，然后75％酒精浸泡lmin，再用含青、链霉素的DPBS清洗。将 睾丸和胎儿组织碎块用眼科剪将其剪碎，加入DPBS离心洗涤2遍。睾丸组织用胰蛋白酶消化液4C 消化12h，再在0．25％的胶原酶中37℃消化30min，然后加入少许DMEM培养液，转入5％c02培养 箱(37℃和最大相对湿度)培养5h，过夜，第二天加入2-3mLDMEM培养液。胎儿组织不进行酶消 化，直接按相似的程序进行原代培养。2—3d后成纤维细胞爬出，以后每3天换液，待细胞长到7卜8096 汇合时，进行传代培养或冷冻保存待用。 1．2．3重构胚的构建 107 将排出第一极体的卵母细胞移入显微操作液静置15rain。在显微操作仪下用改良的两步盲吸一 点击去核法进行去核，得到重构卵。 在显微操作仪上安装两根直径150姗的可活动铂金丝电极，将融合液置于两电极间。然后将重 构卵移到的融合滴中。用其中一根铂金电极丝轻轻拨动重构卵，使供体与卵母细胞膜接触面与电场 方向垂直