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实时荧光定量PCR Contents 实时荧光定量PCR的用途 实时荧光定量PCR的用途 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR技术是指使用Real Time PCR扩增装置，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 实时荧光定量PCR的原理 荧光阀值（Threshold）：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 。 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。 实时荧光定量PCR的原理 Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定，但Ct值相同，Ct值极具重现性。 实时荧光定量PCR的原理 Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量PCR的原理 SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位； SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光； 变性时，DNA双链分开，无荧光； 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号。 实时荧光定量PCR的原理 TaqMan探针为一寡核苷酸: 5’端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任一一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 实时荧光定量PCR的原理 SYBR Green I法与TaqMan Probe法比较 SYBR Green I 法 优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 缺点：引物要求高(要求特异性扩增)、不能进行多重PCR。 TaqMan Probe法 优点：特异性强，能进行多重PCR。 缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。 实时荧光定量PCR的原理 融解曲线分析 影响实验结果的因素 总结 LOGO * LOGO 检验科 李斌 实时荧光定量PCR用途 1 实时荧光定量PCR原理 2 影响实验结果的因素 3 总结 4 定性分析 主要是解决研究对象“有没有”“是不是”的问题 绝对定量 是指用已知的标准曲线来推算未知样本的量 相对定量 是指在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化 病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测 病毒和病原菌检测 生物品种鉴定 SNP解析 mRNA表达量分析 差异显示结果验证 基因芯片结果验证 定性分析 绝对定量 相对定量 荧光标记 荧光基团 荧光染料：SYBR Green 荧光标记：Taq Man Probe Cycle C(t) 1 RNA完整性 RNA一旦降解，所定量的结果就不能正确反映样品mRNA 的量。 RNA提取过程中，防止RNA酶的污染。 2 基因组DNA污染 一、影响对RNA的精确定量； 二、影响PCR扩增的特异性。 3 反应体系的优化 PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物。可以用实时荧光定量试剂盒。 实时荧光定量PCR是一种高特异性、高灵敏度，重现性好的核酸定量分析方法。 检测速度快、方便快捷，无需电泳分析，不接触危险试剂，更加环保安全。 分子生物学研究、临床检测等领域强有力的工具。 LOGO * *