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Confidential 实时荧光定量PCR一般流程 LU Yang Application Specialist Gene Company Ltd 内容 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 实验应用目的 未知样品中目的基因绝对量 比较不同样品中目的基因相对表达量 比较不同样品中目的基因相对表达量 比较不同样品中目的基因相对表达量 检测未知样品基因型 检测未知样品中某种成分的存在与否 Thank you! 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化，从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化，从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化，从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化，从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 概括地说就是实时监测荧光基团的积累变化，从而精确定量起始模板中目的基因拷贝数的技术 CT值取决于阈值 ，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 CT值取决于阈值 ，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 * Date | AB CONFIDENTIAL StepOne? and StepOnePlus? Real-Time PCR Systems ? 2006 Applied Biosystems 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 未知样品中目的基因绝对量：绝对定量 比较不同样品中目的基因相对表达量：相对定量 检测未知样品基因型：SNP分析 检测未知样品中某种成分的存在与否：存在/不存在分析 ……………… 不同实验应用，实验准备不同 标准品： 已知确切浓度，分子结构和目的基因类似 梯度稀释： 至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复： 每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义 标准曲线： 斜率和标准差必须要符合数学意义 不同实验应用，实验准备不同 内参基因：用于数据均一化 扩增效率比较： 比较内参基因和目的基因的扩增效率，以确定相对定量的不同定量模式 △Slope 0.1，使用相对标准曲线法 △Slope 0.1，可以使用比较CT值法 不同实验应用，实验准备不同 △Slope 0.1，使用相对标准曲线法 标准品：内参基因和目的基因，不需知道样品确切浓度 浓度梯度： 至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围 样品重复： 每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义 标准曲线： 斜率和标准差必须要符合数学意义 不同实验应用，实验准备不同 △Slope0.1，使用比较CT值法 内参基因：数据均一化 数学公式：2－ △ △CT 不同实验应用，实验准备不同 荧光探针：两种不同标记，不用两种不同基因型检测 不同荧光表明基因型的不同 不同实验应用，实验准备不同 IPC：阳性对照，检验反应体系工作与否 目的基因探针：荧光信号有无判断存在与否 实验目的 实验方案 实验关键 实验试剂耗材 实验应用方案：基本流程 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对 GeneBank或者文献查找 实验应用方案 引物和探针设计 遵循引物设计的一般规则，特别是多重反应的应用 根据自身情况确定荧光探针的种类 遵循所选探针设计的一般规则 BLAST比对确认引物特异性 实验应用方案 荧光报告基因的选择 根据自身仪器的性能 根据自身实验条件 尽可能选择相对成熟的荧光报告基团：FAM，VIC等 选择高品质引物探针合成商 实验应用方案 标准品制备（标准曲线法） 新鲜标准品 遵循所有标准品制备原则 实验应用方案 退火温度 热启动 引物浓度 引物和探针的纯度 镁离子浓度 模