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ChIP实验步骤 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul?37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul?2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm?5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS?Lysis?Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul?SDS?Lysis?Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g?4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul?5M?NaCl?（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul?ChIP?Dilution?Buffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ul?Protein?A?Agarose/Salmon?Sperm?DNA。4度颠转混匀1h。 10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul?抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。 取100ul超声破碎后产物，加入4ul?5M?NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 第二天： （一）、免疫复合物的沉淀及清洗。 12、孵育过夜后，每管中加入60ul?Protein?A?Agarose/Salmon?Sperm?DNA。 4度颠转2h。 13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。 洗涤溶液：a.?low?salt?wash?buffer----one?wash b.?high?salt?wash?buffer-----one?wash c.?LiCl?wash?buffer------one?wash d.?TE?buffer------two?wash 15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul?10％SDS，?100ul?1M?NaHCO3，?800ul?ddH2O，共1ml。 每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。 16、解交联：每管中加入20ul?5M?NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。 混匀，65度解交联过夜。 第三天： （一）、DNA样品的回收 17、解交联结束后，每管加入1ul?RNaseA（MBI），37度孵育1h。 18、每管加入10ul?0.5M?EDTA，?20ul?1M?Tris.HCl（PH?6.5），2ul?10mg/ml?蛋白酶K。 45度处理2h。 19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul?ddH2O。 （二）、PCR分析?二、技术总结 （一）、关于细胞 细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。 一般细胞长到75％－80％比较好。 （二）、关于抗体！ 抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa?cruz的抗体，即使是IP级别的。 单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。 一般而言，如果没有