遗传变异与进化.docVIP

草原红牛微卫星DNA群体遗传变异分析研究 杨国忠1, 任文陟2, 张嘉保2* ( 1. 河北北方学院牧工系, 河北张家口075131; 2 中国人民解放军军需大学军事兽医系, 吉林长春130062)中图分类号: S823. 8 文献标识码: B 文章编号: 1004 7034( 2005) 0020 02 对于动物而言, 遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上千差万别。通过对群体遗传变异进行分析研究, 可以了解品种的遗传结构、生活背景, 分析其进化历史, 探讨品种濒危的原因和现状, 提出合理的保种措施。研究运用现代分子生物学技术和PPAP 以及计算机凝胶成像分析系统, 从牛基因组DNA 的提取、微卫星引物的PCR扩增、微卫星扩增产物的电泳分型等方面入手, 测定分析草原红牛群体各位点等位基因数、等位基因大小、基因频率、多态信息含量(PIC )、杂合度, 以期从分子水平探讨草原红牛群体的遗传变异, 为草原红牛进一步的选育提供理论依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 试验动物来源及采血方法 试验选用吉林省农科院畜牧分院牛场饲养的纯种草原红牛42头, 颈静脉采血, EDTA抗凝, - 20 保存备用。 1. 1. 2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、4 dNTP、蛋白酶K、RNAase、Tris饱和酚、T ris、EDTA、DNA M arker、N, N!- 亚甲双丙烯酰胺、TEMED、尿素、丙烯酰胺、硝酸银、亲水硅烷、疏水硅烷、引物等。 1. 1. 3 主要仪器 PCR 仪、高速冷冻离心机、核酸测序电泳仪、紫外透射反射分析仪、电子天平等。 1. 2 方法 1. 2. 1 基因组DNA 的提取 参考?分子克隆实验指南# [1] ,略有改进。 1. 2. 2 引物的筛选与合成 选出5条染色体上的8个微卫星位点, 从Internet网进入牛的微卫星数据库, 查出相应的微卫星引物序列, 引物由北京鼎国生物技术发展中心和赛百胜生物技术公司合成。8个微卫星位点的引物序列及PCR扩增反应条件见表1。 1. 2. 3 PCR扩增程序 94 预变性5 min→94 变性30 s→退火45 s→72 延伸45 s, 35 个循环, 反应结束后72 延伸10 min。 1. 2. 4 PCR产物的检测及电泳分型 扩增产物先在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳, 并以核酸相对分子质量标准作对照, 在紫外透射分析仪上观察是否有所需的条带, 若有则继续转到8%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分型。采用银染法经过固定、漂洗、染色、显影、终止及清洗等步骤, 得到凝胶图, 拍照保存以判定基因型。 1. 2. 5 基因型的判定 用凝胶成像系统携带的UVIBANDVe rs ion 99软件中的MW - RF 功能分析计算全部个体各微卫星位点等位基因大小。以大小不同的扩增片段为不同的等位基因, 按等位基因从小到大的顺序分别依次定名为A, B, C, D,E等。分析各微卫星座位全部个体的基因型。 1. 2. 6 统计分析 利用遗传学群体与家系资料计算机分析系统PPAP 3. 0( Popuiation and Ped igree Ana lysis Programs) 软件分别计算本群体各位点基因频率、多态信息含量( PIC)和平均杂合度。 平均多态信息含量( po lym orph ism inform a tion content, PIC ) 其中m 为等位基因数, P i 和Pj 分别为第i和第j个等位基因频率。 平均杂合度( heterozygosity, H ) 其中m 为等位基因数, P i 为第i个等位基因频率。 2 结果与分析 2. 1 基因组DNA 提取结果 对采集的牛血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组20DNA。经0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测, 所提取的DNA在纯度、浓度、大小上均较好, 见图1。 2. 28对微卫星引物扩增结果 对8个微卫星位点的PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 得到PCR产物电泳检测结果, 这里仅以BM2113 电泳图为例来说明, 见图2。 图2 BM 2113聚丙烯酰胺凝胶电泳图 2. 3统计分析 2. 3. 1 等位基因大小及频率 见表2。表2列出了草原红牛8个微卫星位点等位基因大小及频率。可见, 草原红牛8个微卫星位点等位基因数为2~ 5个, TGLA44 和ETH 225最多, 均为5个, IDVGA2 和IDVGA44 为4个, IDVGA46 为3 个, IDV GA55、BM2113和BM 1824 3个位点最少, 仅有2个。各位点等位基因变异范围: ETH 225 为123~ 147 bp、IDVGA2 为130 ~146 bp、IDV