游仆虫中心蛋白基因地研究.pdfVIP

游仆虫中心蛋白基因的研究+ 梁爱华 王伟兰 涛 李晓铃 谭 明 ‘山西大学生物工程研究所 太原03∞06、 (中山大学生物学录．广州510275) 摘要中心蛋白是中心体的组成成分，存在于许多生物体中。对中心蛋白基因的克隆和测序有 助于进一步研究中心蛋白在棒内的功能．本文利用巢居式PcR技术，从游仆虫大核基因组DNA 中扩增出了中心虿自基因片段．将扩增产物克隆至pGEM—T载体中并对该片段的核苷酸序列进 行了分析．根据该序列设计引物，结合游仆虫的端粒序列，从大核基因组中扩增出了该基因的另 外两个片段，为全序列的测定奠定了基础。 关键词游仆虫中心蛋白基因 巢居式PcR克隆 中心体(centrosomes)是细胞内一个重要的细胞器。是多数动物细胞中的微管组成中心 (microtuble organizing centre，MTOCs)，与细胞分裂有关。中心体含有多种蛋白质。其中较 为重要的一种为中心蛋白(centrin)。最近几年的研究表明，中心蛋白在中心体的复制、分离、 andBor、 定位、有丝分裂纺锤体的形成、微管的去组装等过程中起着～定的作用(schiebel nens．1995)。因此，中心蛋自及其基因的研究有利于对中心体这一细胞器的功能和细胞周期 的了解。 本文选择一种原生动物——八肋游仆虫￡印如f“o“of口rin口f“s作为研究对象。游仆虫属 于纤毛纲腹毛目，是一类特殊的单细胞真核生物．在其体内未发现典蛩的中心体结构。因此， 研究这类生物中的中心蛋白基因及其基因产物在细胞中的定位对于弄清没有中心体结构的生 物中微管的形成及细胞分裂机制等问题具有重大理论意义。 现有资料表明，中心蛋白是一个20kDa的钙结合蛋白，约由172个氨基酸组成，与微管 蛋白、组蛋白一样．中心蛋白也是一种较为保守的蛋白质(salisbury．1995)。我们根据已知 的人、鼠、衣藻、酵母等生物的中心蛋白的氨基酸序列设计Bl物，以八肋游仆虫大核基因组 DNA为模板进行PCR，通过优化反应条件，扩增出了八肋游仆虫的中心蛋白基因片段，并对 其核苷酸序列进行了分析。 l材料和方法 1．I八胁游仆虫的培养殛大楼基因组nNA的提取 n口厶，1994)。 见以前报道(Lia“g 1．2八肋游仆虫中心蛋白基因的扩增 比较已知的人、鼠、衣藻、酵母等生物的中心蛋白的氨基酸序列(salisbury，1995)．找 出四个同源性最大的区域，根据遗传密码规则，并考虑到密码子的摇摆性，设计了四个相应的 -国束自然科学基金(No和山西省留学基金资助项日 1014 2．5pmol／L的引物1与引物4各5pl；游仆虫的大核基因组DNAloOng；总体积用ddH：o补 为50一。PcR的扩增条件是：94℃4分钟，加入2．5u TaqDNA聚合酶，94℃1分钟，47。c 1分钟，72。c 2分钟，循环5次后，将退火温度提至52。c，最后再在72℃下延伸10分钟．然 后以2pl扩增出的产物为模板，以引物2和引物3为引物，其它条件同上进行PCR，琼脂糖 凝胶电泳检铡扩增结果。 1．3 PcR产袖的纯化 目的基因片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后甩Pmme驴公司的wizard柱过柱纯化。 操作步骤觅公司的产品使用说明。 1．4目的基因片段的克睦与分析 纯化后的PcR产物直接与质粒载体pGEM—T(购于Prdme弘公司)连接．转化大肠杆菌 Dl{5口，在涂有氨苄青霉素与1PTG、X—gal的LB平板上采用蓝白筛选法辩选阳性克隆．质粒提 取采用碱裂解法t质粒DNA进行限制性酶切分析及P(’R扩增鉴定后，进行DNA序列分析． 寰l扩■八肋游仆虫中心量白基因的引■序爿 2结果 2．1八肋游仆虫中心蛋白基因片段的扩增与克隆 利用引物l与引物4对八肋游仆虫大核基因组DNA进行扩增，得到一些扩增带。但特异 性不强。再以此扩增产物为模板．用引物z与引物3进行PcR，在大约250bp处得到一特异 性扩增产物(