蛋白质组学及其在医学研究中.pptVIP

细胞蛋白质组 一、概述 最早于1994年由澳大利亚一位博士后Wilkins提出,指的是“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。” 整体性、动态性和系统性 Representation of a eukaryotic Cell 定义：蛋白质组学(proteomics),就是从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域 Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function. 二、 蛋白质研究的简要史 1975年 双向凝胶电泳技术 1986年 第一个蛋白质序列数据库-SWISS PROT 1997年 出版了第一部蛋白质组学的专著 2000年3月 首次发表了一个生物体的完整蛋白质组 2001年6月和2001年2月 公布了人类基因组框架图和序列图谱 三、蛋白质组学的研究内容 组成蛋白质组 :一个细胞或组织或机体中所有蛋白质的时空表达状况的分析 功能蛋白质组 :蛋白质的细胞定位、蛋白酶的活性、蛋白质与蛋白质相互作用的连锁关系及其由此实现的信号传递与调控作用 四、蛋白质组研究的主要技术方法 1 .样品处理方法  （1）色谱 （2）亚细胞分级 （3）激光解剖单细胞水平样品制备 （4）电荷分级与亲和分级 （5）变性剂及表面活性剂的作用 2. 二维凝胶电泳技术(2DE) 又称双向电泳,是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法 完整的双向凝胶电泳分析,包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS PAGE斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤  Silver stained 2-D gels from tissue samples of rabbit hearts. 2DE遇到的困难 酸性和碱性蛋白质的分析,ＭＷ较小和较大的蛋白质的分析,低含量蛋白质的分析,高速度自动化,变性后分离不能反映原始状态,疏水性较强的蛋白质分析,手工操作较多、经验性强、可重复性差 3. 蛋白质鉴定—质谱鉴定技术 (MS) 基质辅助激光解析电离质谱(MALDI MS):利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化 电喷雾电离质谱(ESI MS):在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化 通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间(ＴＯＦ),即可计算得到准确的肽段质量 通过稳定同位素标记,还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。 质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等 4. 蛋白质相互作用分析—酵母双杂交技术 分析蛋白质之间的相互作用及其方式,认识与特定生理活动相关的蛋白质网络,绘制出蛋白质相互作用的图谱(interaction mapping） 是一种在细胞内检测蛋白质的相互作用的技术,无需分离纯化蛋白质,是实现大规模高通量分析的主要方法 原理: 真核转录因子含有两个相对独立的功能域:DNA结合(DNAbinding domain,BD)和转录激活(activation domain,AD) 当两者独立存在时,无转录激活功能,但两者只要相互接近,即可激活转录 存在问题： 酵母双杂交技术还存在假阳性和假阴性的发生率高的问题,而且对于不能进入核内的蛋白质(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比较复杂的翻译后修饰作用的高等生物蛋白质,该技术尚不适用 5.多维液相色谱-质谱技术 借助于同位素标记技术 ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotopecoded affinity tags,ICAT) 可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质 ICAT的原理 存在问题： 只对含半胱氨酸残基的蛋白质有效,而不能测定其它的蛋白质和多肽 6. 蛋白芯片或微阵列 蛋白芯片技术的大多数是在玻璃板或膜上对蛋白或抗体进行排列 缺陷：很难或不可能对翻译后修饰进行分析，而翻译后修饰对于大多数疾病又是很关键的 五、蛋白质组研究中的生物信息学 生物信息学已经成为当代生物学和医药学的组成部分,用于巨量生物信息资源的收集、存储、处理、搜索、共享、服务、研究和开发 由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成 1.数据库