烤烟栽培品种G28与K326抗CMV的遗传转化研究.pdfVIP

烤烟栽培品种G28和K326抗CMV的遗传转化研究 陈元生 肖火根 张曙光 范怀忠 (华南农业大学植物病毒研究室．广州510642) 摄翼采用农轩蕾共培养法。将CMV--BS(香蕉辕末)的CP鲞因转入烤蛔栽培品种G2$和K326，获 得了再生转基因烟抹313株．用PCR检刊和DAS--ELISA分析，证明CP基因已整畚到转化姻抹的染 色体中，并得到不同程度的表达．利用CMV--BS、--27和一373十株未，采用机械接种和蚜虫传毒法 分别进行攻毒试验。结果证明：转基因蛔棘对这3十辣来的麦击年表现出1月王的抗病能力，其抗性程度 与CP表达t呈正相关美泰．采用5种攻毒难度处理，发现随着攻毒浓度的增加．转‘因蛔椿的抗病能 力畚适渐蠢弱． 美■调黄瓜茬叶病毒番蕉椿枣 外壳蛋白基因 转善因烟革株来 拭病性 CMV是一种非持久性蚜传病毒，引起烟草、黄瓜、香蕉等许多重要作物发生花叶病，难于进 行治虫防病。因此，利用CMVCP基因的抗CMV基因工程早已引起人们的重视。迄今已有CMV —C、一wL、一O、一Y、一Bs等多个CMV株系的CP基因已分别转入烟草、番茄、甜瓜、黄瓜、 南瓜和西葫芦等作物。 表达CMVCP基因的转基因烟株的抗病性强弱主要与株系间的亲缘关系有关，也与攻毒条件 (如攻毒浓度、攻毒方式)有关，其表现主要为早期抗性。在CMV的众多株系中，许多株系都能 侵染烟草，是导致广东烤烟花叶病的重要病原之一。本研究室李华平(1995)已构建含有cMV— BSCP基因的植物表达载体，并将CMV--BSCP基因转入了土耳其烟和本生烟，但两品种都不是 广东的栽培品种，且还没有鉴定转基因烟草对广东地区烟草CMV和其它作物CMV优势株系的 抗病性。本研究在李华乎研究的基础上，将CMV—BsCP基因转入广东烤烟栽培品种G28和 K326，并应用当地CMV不同株系，对转化烟草的抗病性进行了进一步的研究． 1材料与方法 1．1檀翱与瘸毒株系 广东栽培品种G28和K326(由本研究室提供)作为转化受体植物，接种的病毒株系为广东香 1．2菌种 古CMV--BS 含有CaMV--35S双启动子和NPTI基因。 1．3培养基 1／2 (1)1／2MS培养基，(2)MS，。培养基lMS+0．1mg／l 基：1／2 NAA。 MS+0．2mg／l 1．4基因转化及檀株再生 参照李华平等阿方法。将过夜培养的农杆菌茵藏，用1／2MS液稀释成浓度为l×105个／ml。 选取生长20～30天的组培苗的平展叶片，切成0．5×lcm大小的方块，立即投入菌液里，不时轻 轻摇动，约10分钟后取出，用1／2MS液洗2次，置于不含激素和抗生素的l／2Ms培养基上，于 475 Carb 25℃暗处培养2天。转移叶方块至MS。培养基[含60pg／mlKm(卡那霉素)+500／ug／ml (羧苄青霉素)]上，15小时冷光源光照，9小时黑暗，27℃下培养。待伤口处形成的小芽长至lcm 左右时，将芽切下并转移至含100#g／m[Km的导根培养基上诱导生根。将生根良好的完整植株移 栽至温室内。 1．5转基因烟株的筛选与鉴定 1．5．1 PCR反应的模板。进行PCR扩增。PCR反应程序为：94C，1分钟；55C，1分钟I72℃，0．3分 钟，共35个循环。每个反应的总体积为50／zl。按常规方法，用0．8％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产 物。 1．5．2 CP基因的表达(翻译)分析参照Okuno等的方法提取转化烟株的可溶性蛋白作为抗 测定。以含CMV--BSCP基因的农杆菌为阳性对照，以非转基因烟株为阴性对照。重复3次。 1．6转基因烟株的抗瘸性鉴定： 选取移栽后已有4～5片完全叶的转基因株进行攻毒试验。 常规机械接种法：采用分别感染上述3个株系i0～16天的新鲜西葫芦病叶为毒源材料，分别 ‘ 基因烟株