猪繁殖候选基因ERK1%2f2的cDNA克隆和表达.pdfVIP

猪遗传育种 猪繁殖候选基因ERKl／2的cDNA克隆与表达 胡永胜1，张伟1，方梅霞1～，聂庆华1，张细权1 1华南农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖系，广州510642；2。暨南大学医学院实验动物管理中心，广州510632 关键词：猪；ERKl基因：ERK2基因；克隆 引言 胞外信号调控激酶(Extracellular signal．regulated kinase protein 过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等。许多研究也发现在雌性哺乳动物排卵并生成黄体的过程中，ERKI／2是 启动卵巢排卵的分子信号的至关重要的下游标靶。在卵泡颗粒细胞中缺少ERKl，2的雌性小鼠，其卵母细胞 是不会成熟，不会从滤泡中释放，用激素刺激过的滤泡不会转变为黄体。猪作为人类疾病动物模型中的重要 成员，在这方面的研究还未见报道。迄今为止，有关ERKl／2基凶的研究主要集中在人和小鼠上，有关猪ERKI／2 基因的研究未见任何报道，本文对猪ERKI／2基因开展研究，证实该基因的存在，并初步揭示该基因的结构、 表达规律，为后续的研究奠定基础。 材料与方法 以猪卵巢组织cDNA为模版，扩增猪ERKI／2基因的cDNA。利用Real--timePCR技术分析各组织的ERKl／2 基因的mRNA表达情况。 结果 PCR测序结果，获得猪ER削基因cDNA部分序列，长757 bp，共编码合成252个氨基酸；所获蛋白序 列与人和小鼠的同源性高达99．2％和98．8％。实时荧光定量PCR分析表明，该基因表达量较高的是淋巴，在 脑部组织(大脑、小脑、下丘脑)、消化器官(大肠、小肠、胃)、脂肪组织(背膘、腹脂)、繁育器官(卵巢、 子宫、输卵管)、脾都有表达，在心、胸腺也有少量表达，背肌、后腿肌、前腿肌等肌肉组织不表达。 PCR克隆测序，获得猪ERK2基因cDNA序列1761 bp，包含5’UTR区174bp，编码区1080bp，3’UTR 区507 bp，共编码合成359个氨基酸；所获蛋白序列与人和小鼠的同源性高达99．2％和98．9％。实时荧光定 量PCR分析表明，该基因在脾脏中表达量最高，在大脑、小脑、下丘脑、肝脏、大肠、背肌、淋巴、卵巢、 心脏等组织中也有少量表达。除了正常的剪切体外，实验中还发现了另外3种变异体，均由5’区域的片段缺 失引起。将PCR扩增所得序列与相关的EST序列进行比对，寻找两条序列以上出现变异碱基的SNP，发现： C+237A、G+721A 和T+1157C。 讨论与结论 在人和小鼠中的研究显示ERKI／2是启动卵巢排卵的分子信号的至关重要的下游标靶，在雌性动物排卵 的过程发挥重要作用。本研究PCR克隆获得了猪ERKl／2基因的cDNA序列，并对这两个基因的基因结构、 编码蛋白氨基酸序列、组织表达规律进行了分析。从所得结果看，猪ERKI／2基因与人、小鼠等哺乳动物同 源物有高度保守性，暗示ERKI／2基因在猪基因组内真实存在和表达，并与人、小鼠ERKI／2基因具有类似的 生物学功能。从这两个基因的表达规律看，人和鼠的ERKI／2基因在卵巢、脂肪、心、肺等许多组织都有表 达，也与猪的较为一致，这也反映了ERK2作为不同类型细胞信号传导通路上一个靶点的功能，可以初步预 测猪ERK2将是影响猪生殖调控及繁殖性状的重要候选基因。另外研究中还发现ERK2基因的3个异构体， 这3种异构体缺失的部分都包含了翻译起始位置(A=IG)，导致该蛋白翻译起始位置的改变，甚至有可能导致 该蛋白无法正确的翻译，这3种异构体在人和鼠等其他物种中均未发现，有报道表明人和鼠的ERK2有2个 不同转录本，但仅在3’UTR区有所差异，编码的是同一个蛋白。此外，本研究还发现了ERKI和ERK2基因 共6个SNP，为下～步深入研究猪ERKl／2基因提供了重要参考信息。 致谢 港关键领域重点突破项目(2008A02)资助。 一337—