固定化细胞法连续生产L-苯丙氨酸地研究.pdfVIP

固定化细胞法连续生产L一苯丙氨酸的研究+ 邓趄 季靖彪 (理门大学化工系．厦门361005) 陈祥仁 (厦门大学生物系，厦门361005) 关键词L一苯丙氨醴固定化细胞牿红酵母 引言 肉桂酸和氮在苯丙氨酸解氮酶的作用下可以转化为人体所必需的L．苯丙氨酸，这是合 成苯丙氯酸的一条重要途径．人们已对此途径进行了大量的研究，在国外己实现了工业化 生产【【J。国内以往的研究工作主要集中在游离酶法合成方面B“，而对固定化酶进行连续化 生产鲜有涉及。考虑到固定化酶稳定性好，酶密度高且不易流失等优点．利用其实现连续 化生产将扳具工业意义。 glutm，s)为实验菌种，对其固定化后装入固定床进行连续化实验。 1．实验材料和方法 1 1菌种 中含有诱导产生的PAL。 1 2培养基 请参见文献f51。 1．3实验方法 1．3 i细胞培养：将麦芽糖斜面上长好的菌种接到诱导斜面培养，再转接到液体增殖培养萋 殖培养基中相同条件培养14h．离心，称得细胞湿重，并用pH6左右的磷酸盐缓冲液制成 细胞悬液。 1 32细胞的固定化：称取一定量卡拉胶，加入少量D．山梨醇防止酶在固定化过程中失活， 用缓冲液加热溶解后保温在50℃，加入细胞悬液搅匀，用注射针筒将混合液滴入2％的KCI 溶液中浸泡强化2h得球形固定化颗粒，然后用缓冲液保存。细胞固定化后包埋量为003克 湿细胞／克固定化颗粒，总装牲颗粒量为95克． 1．3 3实验内容：将固定化颗粒装入一夹套式玻璃柱，夹套内通恒温水恒温．反应液由柱底 通入．上部引出．改变操作条件，定期检测出口反应液组成。 ’福建省自然科学基金项目． 1 4分析方法 肉桂酸浓度通过测定波长320nm处的吸光度得到(标准曲线法)。 L一苯丙氮酸由氮基酸分析仪测定，但由于分析成本高，实验中主要检测肉桂酸在反应 过程中的变化情况。 瘁液的nH煎虫酸度汁测定。 细胞量采用干重法测定。测得细胞干湿比为0．23克千细胞／克湿细胞。 2．实验结果与讨论 2．1稀释翠 游离酶用于连续生产时，当稀释率增大至某一临界值，就可能导致酶的大量流夫，而 细胞固定化后再用于固定床连续反应就不会出现这一现象．所以在一定范围内可以通过加 尢黼释率来增加总生产能力。厘同时也必须考虑稀释率过高可能会导致原料的利用率降低。 从图l(图中生产能力单位为每克湿细胞每小时转化的肉桂酸鼍克数，下同)可以看出，生 产能力虽呈单调上升趋势，但在稀释率高于2、25h1时上升趋势已逐渐变缓．造成这一结果 的直接原因就是原料的利用率降低。原料不能充分利用不仅在经济上不合算．还会给下游 苯丙氯酸的分离带来不利影响。 dilution rate(1／h) 图I稀释率的影响 图2底物浓度的影响 温度30℃．氨水：2M．肉挂酸：I 温度：30℃，氨水：2M,稀释翠：1 ％，pH：10 38h‘．pH：10 ■底物反应蠢． ▲生产能力 一底物反应量，▲生产能力 Effectofdilutionrate EITec／ofsubstrateconcentration Fig Fig，2 2．2肉桂酸浓度 有研究表明肉硅酸对PAL具有双重作用¨1，即商浓度的抑制作用和低浓度的激活作用， 认为肉桂酸的反应浓度宜在l5％左右。但对连续过程而言，一方面底物的流动会改变酶反 应过程中的传质状况，从而对酶反应本身产生影响：另一方面酶经固定化后虽然密度增高， 但与游离酶反应相比，底物分子在固定化颗粒中的传质阻力也大大增加。因此连续反应对 底物的要求也与游离酶的间歇反应不同。图2的结果表明，肉桂酸浓度在24％左右比较适 宜。实验得出肉桂酸浓度大于【5％可能是由于固定化颗粒的扩散阻力较大所致。当稀释率 发生变化时．适宜的底物浓度也会随之变化，因此对于