大鼠肠道菌群基因组DNA提取与其多态性分析.pdfVIP

僵2吣2008中国药理学会 ＼，耐∥药学发展前沿论坛 大鼠肠道菌群基因组DNA提取及其多态性分析 孙海峰1‘2，刘伟1‘2，张力增1，郭小青1，秦雪准10 1山西大学中医药现代化研究中心，2山西大学化学化工学院，山西太原030006 摘要：口服中药与肠道菌群之间存在着错综复杂的关系，为了研究口服中药对肠道菌 群结构和组成的影响，很有必要建立一种肠道菌群基因组DNA提取和多态性分析的切 实可行的方法。本文综合考察了冻存样品和新鲜样品在不同的前处理阶段、提取过程 中的差异性。发现冻存后样品更有利于后续操作，且不同洗涤液影响样品的洗涤效 果。此外根据肠杆菌基因间的重复共有序列，建立起本实验室可行的ERIC．PCR方 法。该方法学的建立将有利于下一步分析口服精神类中药与肠道菌群相互作用的研 究。 关键词：肠道菌群，基因组DNA，提取，ERIC．PCR 越来越多的研究表明：肠道微生物之间以及微生物与宿主之间存在着错综复杂而 又相对稳定的关系，肠道内微生物群落的组成取决于微生物与宿主之间的交互作用， 宿主为微生物提供栖息的环境，而这些微生物又直接参与机体的消化营养过程，起到 人体屏障作用和拮抗作用【1l【21131。这些微生物与宿主免疫力、内分泌系统、消化系统、 刺激研究其对肠道菌群的影响结果表明：这种精神刺激导致大鼠肠道菌群数量的增 加，引起菌群结果的改变。揭示出肠道菌群分析在应激相关的精神失调症如抑郁症机 理研究中的重要作用。本文即通过比较目前常用的两种肠道菌群基因组DNA提取方 法，确定并细化了一种大鼠肠道菌群基因组DNA提取方法。在此基础上，通过ERIC (EnterobacterialRepetitiveIntergenic 方法15J，比较分析了目前常用的几种DNA聚合酶的扩增效果。 材料与方法 标本来源 实验用粪便采用无菌方法获得后，置于．20℃冰箱备用；或直接取新鲜样品。 样品处理方法 43 ㈣2008中国药理学会 嫦乇∥药学发展前沿论坛 ml生理盐水和0．05mol·L-1磷酸盐缓冲 分别取0．29新鲜和冷冻后粪便样品，分别用2 9000rpm离心3分钟，弃上清，收集菌体沉淀。再用冰冷的无水乙醇洗涤菌体两次，用 于后续基因组DNA的提取。 基因组DNA的提取 稍有改动。与文献报道不同的是，蛋白酶K水解反应在55℃作用1h。a队B／NaCl法提取 步骤如下：首先利用50毗lTE溶液悬起菌体，加入1靴l 用1h，而后加A53#l10％SDS、1毗l 5mol·L-1 NaCI溶液并颠倒混匀，再加入14取l 10min；用等量的 氯仿：异戊醇(24：1，v：v)12，000 rpm离心抽提2次(5min)，保留上清液；等体积异丙 TERNase溶解DNA，37℃ 醇沉淀DNA，13，000ipm离心10rain，弃上清；用200／A 仿：异戊醇(25：24：1)、氯仿：异戊醇抽提，并将最后离心的上清液转移至新的EP管 75％乙醇洗涤 中；用等体积的异丙醇沉淀，13，000rpm离一L,10min，弃上清，用300／比1 DNA后，室温干燥，溶于5毗lTE中，．20℃保存备用。 ERIC．PCR反应条件的优化 ERIC序列是首先在肠道细菌基因组中发现的长为126bp的非编码保守重复序列， 该序列在不同细菌中的拷贝数和定位都不同。目前利用ERIC保守序列设计的引物对细 5’．ATGTAAGCTCCTGGGG