TFPI-2基因原核表达与重组TFPI-2生物活性研究.pdfVIP

·287· TFPI一2基因原核表达及重组TFPI一2生物活性研究 宁勇黄瑞滨宋善俊 factor inhibitor一 组织因子途径抑制物2(tissuepathway 基质胶Matrigd 2，TFPI一2)是新近发现的～种分子量为32KD的丝氨酸蛋技大学血研究所仲任博士提供。 2．TFPI一2原核表达以人TFPI一2 白酶抑制剂，与先前报道的胎盘蛋白5(placentalprotein一5， eDNA为模板，参照 sef— PPS)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制物(matrix—associated提供的引物序列，设计引物：上游：5’一僦ATC- CAl℃蕊AGCl℃XMAGGAGCCA一3’一 ineproteaseinhibitor，MSPI)为同一物质。体外研究发现， ，下游：5’ 111KAAll、(矾AA TFPI一2可抑制纤溶酶、胰蛋白酶，基质金属蛋白酶1(mat血 metalloproteinase1，MMP一1)和基质金属蛋白酶3(M^口一 3)等多种蛋白酶，在维持细胞基质重魍及血管生成、调控肿瘤 细胞转移、调节细胞凋亡及血液凝固等方面可能具有重要作 一2eDNA中除去信号肽外部分，也就是编码成熟蛋白的国一 用。髓甲I一2基因位于人类7号染色体，7q22，全长约7．0kb， 碱解法制备n甲I一2 含有5个外显子和4个内含子，每一个Kunitz结构域都由单 一外显子编码，所有外显子和内含子周围的核苷酸序列都比 溶解沉淀，37℃保温45分钟，至RNA完全降解；保存于一 较保守，服从GT—AG原则。编码产物由予糖基化程度不20℃冰箱中备用。(2)用氯化钙法制备大肠杆菌Ⅸ巧a感受 同，具有三种分子量形式：27KD、31KD、32KD，体内主要以 32KD形式存在。糖基化程度不同只影响细胞分泌TFPI一2 (EB)的0．8％的琼脂糖凝胶中电泳分离各片段，回收∞冲l一 的速率，不影响其与细胞外基质(ex删ularmatrix，ECM)结 合及生物学活性。 2片段并电泳验证。(4)使用MBI生产的T4liagase体系。连 研究TFPI一2与肿瘤侵袭转移的关系是近年研究热点 之一。因为一些肿瘤细胞自身可生成和分泌多种丝氨酸蛋白 酶如纤溶酶、胰蛋白酶、胶原酶、组织蛋白酶等，这些蛋白酶可 受态细胞，以无菌牙签挑取LB平板上的单个阳性菌落，接种 降解大多数基质物质，从而破坏ECM，利于肿瘤细胞侵袭转 到5ml含卡拉霉素的LB培养基中，以异丙基硫代半乳糖苷 移，在这些丝氨酸蛋白酶中，纤溶酶可能与肿瘤细胞的侵袭转 (掣rG)为诱导物，于37℃220rrnn摇床培养过夜。 移关系最为密切。但人血浆中纤溶酶的天然抑制物a一抗纤 溶酶和a一巨球蛋白对与ECM结合的和域肿瘤细胞表面的PCR扩增，取其产物进行琼脂糖电泳。(2)煮沸法提取菌落 纤溶酶却没有抑制作用。通过对绒毛膜癌细胞、黑色素瘤细 胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞及神经胶质瘤细胞等多种肿瘤细 30 个循环，72℃延伸10min。引物为TFPI一2的特异性引物。 胞研究后发现，11巾I一2可以明显抑制这些肿瘤细胞的侵袭 4．SDS—PAGE电泳分离蛋白质采用垂直电泳方法，分 转移能力。因此继续加强对TFPI一2与肿瘤细胞浸润转移 离胶为：ddH