表达并运送重大禽病病毒蛋白的转基因球虫体系——一种高效诱导保护性黏膜免疫与细胞免疫的大容量活载体疫苗生产体系.pdfVIP

表达并运送重大禽病病毒蛋白的转基因球虫体系 ——一种高效诱导保护性黏膜免疫和细胞免疫的大容量活载体疫苗生产体系 刘贤勇 索 勋 中国农业大学动物医学院，北京．100094 关键词转基因球虫茹膜免疫细胞免疫疫苗活成体 懂界弊禽韭的发展始终簸在熏大痰病威胁的阴影中，每年遭受着因禽流感、新城痰及传染性支气舒 炎等病毒瘾以及多种细落和寄生原虫病所造成的巨额经济损失[1～．】，近年来禽流感还蠢接给人类健康 造成了巨大威胁c5“】．对付各种禽病毒病主要依捺灭活疫蕊翻弱毒笛等传统疫苗进豁群体免疫．旋细 菌病和寄生虫筑的防治魁主要依褴于添加予饲喂系统中的务种抗生素和抗原虫药物。髓着人们对药物 残筐和耐药瘸原的产生等日趋严峻的问题的关注以及生命科学的巨大进步．辩学界在疫病新型防狡策 略的研究。尤其在嫠型疫苗豹研究方面进行着努力的探索H“o】．基于预防鸡球虫病豹?舌卵囊疫菌的广 泛使用和分子生物学的飞跃发展，我们设想利用鸡球虫建立一个转基因系统。即将具有良好免疫愿性的 抗原蛋白基因的转基因球虫)，得到一个或多个能稳定表达外源病毒簇因的转纂因球虫系．由于活卵囊 疫苗在田闻使用畦，球患在鸡体内经4～7天的细胞内发育即捧出体外，一般再经进三次的自然墅复感 染即使鸡产生对球虫的。绝对”抵抗[I叼——那么转基因球虫作为疫蘅接种鸡之后也会重复上述的繁殖 过程．选时转基因球虫所携带的外源病毒抗原基因将表达网次，从而多次诱导肠道黏膜免疫和细胞免疫 的产生．这样的结果即相当干给鸡进行了四次病毒病疫苗的免疫．第一次为初次免疫。而后三次为加强 免疫，这缀可能利激搬体产生有效的抗病毒保护效果。从而达到一苗甄弼或多用的目的．这种转基因球 虫体系作为活疫苗载体生产系统较之其他真棱纲眶及病毒、细莲的疫苗载体系统共有独特优势。最明显 高，生产与接种简单易行．在参考倭复台门寄生原虫转基因研究的基础上[1”…．我{}丁研究小缀正在进 行转基因球虫体系建立的初期研究工作． 一、主要工作 (一)瞬时转染栽俸构建方面 础，在备报告基因的上游位点和下游位点分别插人柔嫩艾美尔球虫不冈基因的上下瓣调控序列，构建了 序列的重组报告载体在柔嫩艾龚尔球虫子孢子中是否可以瞬时表达．通过电穿孔法将黄色荧光蛋白基 因两侧为黍嫩艾茭尔球虫基因侧嚣键控净列的载体转染入子孢子，然后接种转染后的子孢子于MDBK 单层培养雏胞上．在培养过程中，我们在荧光显微镜下观察到了表达黄色荧光的各个发育阶段的虫体． ·49’ (二)转染方法的探索和优化 我们利用电穿孔介导的转染、显微注射以蔑基因抢等方法在进行柔嫩艾癸尔球虫转染实验．我们 已成功建立了瞬间转染予孢予的系统．利用碘化丙锭和罗丹明这两种染料进行的电击实验迸明了小分 予可以在电击条件下进入球虫卵囊的细胞浆．在一次电击转染实验中。成功地在荧光显徽镜下观察到 表达黄色荧光蛋自的孢子化进程中的郛囊，其明显与卵囊的自发荧光相区别，但随后来有重复得到相同 的实验结果，这说明卵囊电击转絷仍然有很多束知条件需要探索．另外，我们参照动物胚胎的显微注射 以成功地被注射人少盘的质粒DNA溶液，这使得进一步忍鼎微注射操作将外源基因导A球虫卵囊成 为可能． 二、转基因系统转基因球虫系统建立工作 (一)转基因打靶裁体的构建、转染与整合型转染后代球虫的9搴选 打靶载体需将打靶序列、球虫鏊因弼控序列、外繇基因、药物筛选标记表达框等元件构建到同一载 蛋白水平上的各种鉴定方法可以确认得到整台袭达的转基因球虫． (二)整合位点、表达时空与强度等必要因素的分析与优化 转基因在球虫细胞内的表达需要考虑到攥合位点的选择，否则不能得到可完全发育的球虫I需要筛 选得别在表达时间、表达产物的定位以及表达的丰度等方圃可以调节外源病毒基因表迭的上游廖动序 列、信号肚序列以及下游调拄序列． (三)转基因球虫禽病病毒蛋白的表达与检测 科用已经优化的表达栽体系统在辣虫细胞内表达病毒蛋白，整之可以在窿主体内发育阶段分泌表 达·井在球虫的特定发育阶段检测到球虫细胞癌及宿主细胞内病毒蛋白的存在。 (四)鸡对袁迭病毒蛋白的转基因球虫产生免疫应答的机理研宄 转基因球虫免疫接种鸡后，宿主对球虫及其表达分泌的痰毒臻自产生的免疫应答厦应．需要对免 疫皮答的产生时阍、反应类型以及