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微生物脂肪酶的专题研究概述 黄建忠，施巧琴，吴松刚 工业微生物教育部工程研究中心(福建师范大学，福州350007) 脂肪酶是一种特殊的酯键水解界面酶，应用范围极其广泛，是国家重点支持与 发展的工业酶制剂。本研发团队是国内最早从事微生物碱性脂肪酶的学术群体， 对微生物脂肪酶进行了长期的研究与开发。20多年来，我们承担了国家“863”计 划、国家科技支撑计划、国家自然科学基金、国家火炬高新技术计划、福建省重 大科技攻关计划、福建省自然科学基金重大项目和福建省产业化技术开发项目等 来源的近三十个与微生物脂肪酶有关的研究项目。现将近年来微生物脂肪酶的系 列研究成果概述如下： 1、脂肪酶产生菌资源库的建立 1．1、通过特异的选择性培养基富集筛选，建立了脂肪酶产生菌的高通量筛选技 术体系和相应的技术平台。 1．2、现已保存脂肪酶产生菌68种，136株，包括细菌、放线菌、酵母、丝状真 菌和大型真菌等。 2、建立了从微生物细胞中高效克隆脂肪酶基因的技术体系 2．1、真核微生物：RT—PCR结合RACE 2．2、原核微生物：文库筛选 3、建立了高效表达微生物脂肪酶的技术体系 3．1、构建了以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为启动子的新型毕赤酵母表达体系： 鲥脯动子具有很强的组成型表达能力，可以葡萄糖、甘油等无毒物质为碳源，且 表达时无需更换碳源，更无需甲醇的诱导。 3．2、构建了脂肪酶多拷贝表达质粒，并将表达质粒转化巴斯德毕赤酵母构建成 多拷贝基因工程菌，有效地提高了脂肪酶在巴斯德毕赤酵母中的表达水平。 3．4、实现了脂肪酶基因与分子伴侣的共表达 4、建立了脂肪酶分子定向改造的技术平台 4．1、根据酯酶的氨基酸序列，结合氨基酸性质，设计开盖型脂肪酶分子。运用 基因工程手段，对脂肪酶盖子结构两侧铰链区的氨基酸进行定点突变、将脂肪酶 “盖子结构及两侧铰链区的氨基酸片段与酯酶对应区域的氨基酸片段相互置换， 获得了开盖型脂肪酶分子，酶的比活提高了5．7倍，酶在两相催化系统中的稳定性 提高了1．8倍。 4．2、揭示了不同氨基酸突变对脂肪酶界面激活催化特性影响的作用机制。利用 已解析的脂肪酶3D结构提供的信息，结合筛选到的性能优良的开盖型脂肪酶突变 体，利用分子动力学揭示了脂肪酶在油水界面触发构像变化的分子机制。 4．3、利用单点突变和叠加突变技术手段，对多种脂肪酶进行热稳定性的蛋白质 工程改造。通过重叠延{申PCR的方法，获得了系列突变基因，其中有13株热稳定性 有显著改善的叠加突变脂肪酶，有5株PH适应性更加广泛的酶突变体。 5、建立了高效生产碱性脂肪酶的工程化技术体系 5．1、实现规模化生产碱性脂肪酶高效表达的现代技术装备 5．2、建立碱性脂肪酶生产的优化控制系统 32 6、建立了脂肪酶高效纯化制各技术体系 6．1、实现脂肪酶高效纯化的现代技术装备 6．2、建立脂肪酶高效纯化的最新技术体系 7、扩大微生物脂肪酶应用范围的专项研究 7．1、微生物脂肪酶在造纸工业中的应用 7．2、微生物脂肪酶在食品工业中的应用 7．3、微生物脂肪酶在生物化工业中的应用 7．4、微生物脂肪酶在饲料工业中的应用 7．5、微生物脂肪酶在制药工业中的应用 7．6、微生物脂肪酶在制革工业中的应用 33