四川省部分地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定与espp2基因序列分析.pdfVIP

四川省畜牧兽医学会2014年学术年会 四川省部分地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定 及e卿2基因序列分析 魏兴良1’2 董 敏1’2 张禄滑1’2 丁玲强1’2 赖陆叶1’2 闫雪锋1’2 余敏1’2 文翼平1’2。 文心田1’2’3黄小波1’2’3 伍锐1’2’3曹三杰1’2’¨ (1．四川农业大学预防兽医研究系猪病研究中心，四川雅安625014； 2．四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室，四川成都611130； 3．农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站，四川雅安625014) 摘 要 为了解四川省副猪嗜血杆茵病的流行情况及分析分离株espp2基因，本研究从2013年8月到 12月分离该菌并扩增其邪pp2基因进行序列分析。结果分离到12株副猪嗜血杆菌，镜检发现为革兰氏阴性 短杆菌；卫星试验表明分离株在金黄色葡萄球菌周围产生卫星现象；生化试验显示分离株发酵葡萄糖、麦芽 糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素、D一核糖和精氨酸水解酶；PcR鉴定发现均扩增约821 bp的目的片段。药敏试验显示分离株对氟苯尼考、先锋霉素V、阿莫西林、强力霉素和环丙氟哌酸敏感。扩 大于97％，表明副猪嗜血杆菌es印2基因变异度低，较保守。 关键词 副猪嗜血杆菌；分离；鉴定；仰2基因；序列分析 副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(胁伽印蒯wpn麟u厶，Hpn瑚M如)在一定条件下引起的猪多发性浆 膜炎、胸膜炎、多发性关节炎和脑膜炎的疾病。副猪嗜血杆菌本来是猪上呼吸道的一种常在菌，可以影响2 周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5—8周龄的猪，发病率一般约10％一 15％，严重时死亡率可达50％，该病已成为全球范围内影响养猪业的严重细菌性疾病。副猪嗜血杆菌的血 清型非常复杂，目前主要按琼脂扩散血清分型方法分型，本菌至少可以分为15个不同的血清型，且不同血 清型之间毒力不同，另外，仍有20％以上的分离株不能确定血清型。 2009年，陈焕春等发现副猪嗜血杆菌SH0165存在三个自转运蛋白基因，其中包括两个胞外丝氨酸蛋白 extracellularserine 酶(putative 运蛋白能够将自身的Passenger结构域运输到胞外。在已报道的文献中，自转运蛋白与细菌的粘附、人侵和 基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303034) 作者简介：魏兴良(1990一)，男，主要研究方向：动物传染病学。 $通讯作者：曹三杰，E-mail：csanjie@grIlail．com 十五个血清型的副猪嗜血杆菌标准株中均存在，但是具体各血清型之间的序列相似性如何却不得而知。为 了解四川省副猪嗜血杆菌病的流行情况及各分离株e卿2基因序列的差异，本实验从四川省多个地方采集 病料分离并鉴定副猪嗜血杆菌，并扩增副猪嗜血杆菌分离株的唧2基因，分析分离株之间的序列差异，构 建基因进化树比较分离株的亲缘关系。 1材料与方法 1．1 材 料 1．1．1病料 2013年8月至12月从四川省乐山市、广安市、雅安市和南充市采集的猪病料组织。病料主要为胸腹腔 积水、心包积液、肺脏、心血、关节液和脑组织等。病猪出现呼吸困难、消瘦、关节肿大和跛行等症状，有些病 例出现震颤划水样等神经症状。剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎及脑膜炎等。 1．1．2主要试剂 琼脂糖购自Invitmgen公司、犊牛血清购自杭州四季青生物有限公司、1sA(Trypticsoyagar)培养基、rIsB soy (脚ptic 集团上海化学试剂公司；微量生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒购白天 Version 2×Taqm鹊terMix购自天根生化科技(北京)有限公司、PremixTaqTM(ExTaqTM 2．0)购自宝生物工 Vector 程(大连)有限公司、pGEM@一TEasy SystemI购自Pmmega公司。 1．1．3 菌株 YAHPs2013101801、YAHPs2013101802、XCHPS2013101904、XCHPS2013101905、 YC02、PA01、PA02、PA03和PA04。 1．2 方