基因工程实验须知.docVIP

基因工程实验须知 一、每次实验前必须预习实验内容，了解实验的基本原理、操作步骤，禁止不预习就做实验。 二、每次实验必须做好实验记录,每次实验完成后，根据记录写出实验报告。 三、实验所得结果，如不再供下一次实验用，应交给指导教师，并注明名称、数量、组别、姓名等。 四、实验室应经常保持整洁、桌面上不要乱放与本次实验无关的书籍、仪器、药品。火柴头、废纸、废液等应放入废液桶中。倒入水槽中的废液（无污染的）立即放水冲掉。 五、爱护仪器、节约药品。仪器损坏后应立即报损，并按规定赔偿。 六、试验、药品、公用器具使用后应立即放回原处，注意不要调错试剂瓶塞或滴管,以免污染药品。 七、实验室必须安静，不得阅读与本次实验无关的书籍：禁止吸烟及吃食物。 八、根据实验记录，及时完成实验报告，不按时交报告者，不予记录实验成绩。 九、实验完毕，值日生应将实验室打扫干净，关好水、电、门、窗，离开实验室时，检查一遍，以免发生事故，确保安全。 实验一 植物基因组DNA提取 目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。 原理： 用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。 材料 植物的根、茎、叶。 设备 移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。 试剂 CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。 其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。 操作步骤 选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。 将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。 加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入的预冷的异丙醇轻轻混匀度放置，离心×5min，去上清。 再沉淀中加入的温育，沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀离心×5min，去上清加入体积的-预冷的异丙醇轻轻混匀放置。离心×5min，去上清。 用乙醇清洗沉淀两次，真空抽干，加入μl TE溶解后置于备用提示： 酚、氯仿、异戊醇的作用： 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大，经过离心与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开，而酚与氯仿有机溶剂比重大，保留在最下层。 作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊。酚的变形作用大，但酚与水能有一定程度的互溶，因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变形作用不如酚效果好，但氯仿不与水相容，不会带走DNA，所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合(1:1)使用。 异戊醇能降低分子表面的张力，可以减少抽提过程中的泡沫产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 实验 基因的PCR扩曾反应（聚合酶链式反应） 目的： 学习PCR反应的基本原理及相关实验技术 原理： 聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）实质是体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链以后，DNA聚合酶以单链DNA为模版，并利用反应混合物中的四种dNTP，以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物，合成新的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定，经过PCR的循环即模板DNA变性为单链、引物与模板退火（杂交）、DNA合成三步骤的反复重复，最后，两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n，使特定的DNA区段得到迅速、大量的扩