臭氧对赤点石斑鱼神经坏死病毒RNA破坏效果的评价方法的建立与应用.pdfVIP

第 36卷 第 1期 渔 业 科 学 进 展 VOlI36．NO．1 2015 年 2 月 PR0GRESS IN FISHERY SCIENCES Feb．，2015 DOI：10．11758y／ykxjz http：／w／ww．yykxjz．cn／ 臭氧对赤点石斑鱼神经坏死病毒RNA 破坏效果的评价方法的建立与应用水 李 晋 ，2 史成银 王胜强 ，2 粟子丹 ，2 (1．农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071； 2．上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306) 摘要 本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red．spottedgroupernervousnecrosisvirus，RGNNV) RNA2的序列，在其3端设计反转录引物，在5端设计PCR扩增引物，构建了一种可以评价RNA 链相对完整性的RT-PCR方法，命名为LRRT-PCR(LeftreversetranscriptRightamplifyRT-PCR)，并 对该方法的引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、退火温度4个重要参数进行了优化。结果显示，优 化后的LRRT-PCR反应体系为：引物浓度 0．2btmol／L、Mg2浓度4mmol／L、dNTPs浓度0．5nmol、退 火温度60℃。本研究建立的LRRT-PCR方法灵敏度高，可以检出1Pg的RGNNVRNA2标准品； 该方法特异性强，与RSIV等鱼类常见病毒、鳗弧菌等常见水产病原菌以及石斑鱼RNA均不产生 交叉反应。应用建立的LRRT-PCR方法对臭氧破坏RGNNVRNA2的效果进行评价，发现当臭氧 浓度由0．3mg／L依次增加为0．5、1．0、2．0mg／L时，LRRT-PCR的扩增产物逐渐减少，直至消失。 结果表明，建立的LRRT-PCR方法可以快速、准确地评价臭氧对RGNNVRNA2的破坏效果，适 用于养殖场评估臭氧对RGNNV的消毒效果，并对RGNNV进行检测和监控。 关键词 赤点石斑鱼神经坏死病毒；RT—PCR；检测；臭氧；消毒 中图分类号 $943 文献标识码 A 文章编号 1000．7075(2015)01．0018．08 臭氧作为一种强氧化剂，主要通过破坏病毒核酸 性 引物进行反转录则更为局 限，只要断裂 的病毒 并使其断裂 ，从而达到杀灭病毒 的作用(Royetal， RNA上还存在 RT-PCR 目标扩增区域 ，就可以被反 向 1981；Shinetal，2003；Thurston-Enriquezetal，2005)。 引物反转录成 cDNA并继而进行 PCR扩增 。上述两 但是臭氧对病毒的杀灭效果 ，除了细胞培养和动物感 类常规RT-PCR方法均不能区分完整和断裂的病毒核 染法之外，还没有合适的方法可以进行评价。对于单 酸 ，对于核酸链 已断裂从而失活的病毒仍可扩增出阳 链 RNA病毒，国内外通常使用 RT-PCR方法进行病 性结果 ，因此不能用于评价臭氧对病毒的杀灭效果 毒检测 ，即采用随机引物或反向特异性引物对病毒反 (Rodriguezetal，2009)。 转录，然后选取部分反转录片段进行 PCR扩~~(Dalla 赤点石斑鱼神经坏死病毒 (Red．spottedgrouper etal，2000；Grotmoletal，2000；Muetal，2013)。但是， nervousnecrosisvirus，RGNNV)是一种单链 RNA病 被臭氧处理后断裂的病毒 RNA，虽然已失去感染活 毒，隶属于野 田村病毒科(Nodaviridae)、乙型野田村 性 ，随机引物仍可与之结合并启动反转录，然后通过 病毒属(Betanodavirus)，是海水养殖鱼类主要的病毒 PCR获得扩增产物 ，产生假阳性结果。