猪链球菌流行病学与其生物被膜形成机理研究.pdfVIP

国家农业行业科技及国家生猪产业技术体系：第十二届全国规模化5蔷场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 l83 博士论文摘录 猪链球菌流行病学及其生物被膜形成机理研究 博士生：魏子贡导师：金梅林 (华中农业大学，武汉430070) 摘 要 猪链球菌是一种重要的人畜共患致病性病原菌，可以导致宿主出现化脓性脑膜炎、败血症、心内膜炎、 猪链球菌疫情将猪链球菌的公共卫生意义提升到一个新高度。本研究系统分析了猪链球菌在我国猪链球菌 病中的重要性、相关毒力因子及基因型与致病力的关系。猪血浆中的主要成分血纤维蛋白原能够诱导猪链 球菌形成生物被膜，病原菌形成生物被膜是病原菌致病的一种机制，通过形成生物被膜，细菌变成持续性 感染，抵抗宿主先天性和特异性免疫系统的清除，帮助细菌抵抗抗生素的杀害。本研究发现生物被膜形成 能力的菌株对比相同基因型的菌株的毒力减弱。通过生物芯片对猪链球菌生物被膜形成后的转录组与未形 成生物被膜的转录组进行了比较分析，发现并验证了两个与生物被膜和致病力相关的基因。现将主要研究 结果报告如下： ’ 1 我国猪链球菌分子流行病学相关研究 球菌总数的56．6％，已经取代马链球菌兽疫亚种成为我国猪链球菌病的主要病原。在这些猪链球菌中，血 系统感染病例中的比例始终最高。3型猪链球菌的在肺炎型病例中的重要性已经下降，21型有上升趋势， 2型猪链球菌已经成为我国猪链球菌病的主要血清型。通过四环素抗性基因种类分析和MLST分型，我国 爆发的人猪链球菌菌株在这些2型链球菌中仅少量存在。我国分离菌株大部分处于毒力强的STl和 实验结果提示猪链球菌的抗吞噬能力与ST型密切相关。STI相关菌株最强，ST7，ST27 次，其他ST型菌株最弱。最后，为了快速对这些猪链球菌进行MLST鉴定进行流行病学分析，建立了核 酸质谱分型方法，该方法完成分析仅需要6．5小时，为快速对猪链球菌进行分型奠定基础。 2猪链球菌生物被膜形成菌株的初步应用 184 国家农业行业科技及国家生猪产业技术体系：第十二届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 从大量的临床分离株中发现了一株具有生物被膜形成能力，基因型s6件所伊+缨7=卜的低毒力2型猪链球 菌菌株。实验证明该株菌对猪具有很强的免疫原性，用该菌免疫猪后能够抵抗2型强毒的攻击，但是对仔 猪的安全剂量为5000万。因此，为了保留其免疫原性，进一步提高此菌株的安全性，．继续对该菌的芳香 族氨基酸合成相关基因aroC基因进行缺失。结果表明：突变株在未补加芳香簇氨基酸的培养基中生长速 度显著下降，但是当培养基中添加三种芳香簇氨基酸后，其生长速度回复。为检测其安全性和免疫效力， 用l亿和lO亿两个剂量组分别免疫仔猪，二免后第二周检测抗体同时攻毒。两个剂量组免疫后安全性良 好。第二次免疫后第二周，用2型猪链球菌荚膜多糖包被ELISA板测定抗体水平显著上升。攻毒保护实验 结果表明对照组在第3天全部死亡，l亿免疫剂量组2／4保护，保护率50％。10亿免疫剂量组3／4保护， 保护率75％。取免疫保护组和对照组攻毒后的组织(脑，肺，心肌，脾脏)进行病理切片分析其病理变化， 结果表明：对照组对比免疫保护组，存在明显的脑神经元坏死，心肌出血，脾坏死。对照组比免疫保护组 的肺组织存在更严重的肺不张。 3猪链球菌生物被膜形成机制初步探讨及新的毒力相关基因发掘 通过比较普通培养基和添加纤维蛋白原的培养基中培养的猪链球菌转录组的差异来探讨猪链球菌形 成生物被膜的机制。 上调。生物被膜形成的过程中由于周围营养物质的浓度降低，细菌的生长开始延缓，相应的细菌的代谢速 度降低，大量蛋白质合成相关基因，核糖体结构蛋白相关基因，氨基酸合成与转运相关基因，糖类转运和 代谢相关基因，DNA复制相关基因下调表达。另一方面，细菌通过生物被膜形成，下调表达细胞壁和荚 膜多糖合成相关基因，上调表达菌毛输出相关基因和Sortase基因，溶血素相关基因等，这些基因的上调 表达为猪链球菌在宿主黏附定植从而建立感染。 暗示这两个基因与生物被膜形成密切相关。继续构建突变体和回复突变体验证其功能，结果表明两个基因