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利用扩张床技术高效纯化牛血红蛋白 金业涛 赵东旭 路秀玲 苏志国 (中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100080) 摘要 利用StreamlineSP扩张床吸附技术甘新鲜的牛血红细胞破碎液中的血红蛋白进行了纯化，并与 膜过滤一层析技术进行了比较。牛血经分桨处理所得的压积红细胞稀释30倍后，所得破碎液的渗进 压符合扩张床吸附的要求。该方法节省了离心或橄滤除碎片的步赚，纯化的血红蛋白的凝胶过滤显示 血红蛋白纯度约为99%,SDS图语上无其它杂蛋白带，高铁血红蛋白水平占总血红蛋白的 5.4%。膜过滤一层析法所得的制备物尽管在凝胶过滤图语中仅有一个单峰，但其SDS圈语表 明有破酸奸醉存在。该文最后对两种方法纯化牛血红蛋白的机制进行了分析。 关妞词 牛血红蛋(1 St*eemlfaeSP 膜过滤 阴离子交换层析 X 捐献血液输血传播HIV、乙肝等病毒的潜在可能威胁着输血的安全，由此激发了血液代用品 的开发与研究。目前，血液代用品可分为全氟碳化合物和基于血红蛋白 (Hb)的血液代用品两 大类。其中以血红蛋白为基础的血液代用品是研究的重点并取得了突破性的进展[’2!，某些产品 已经完成或部分完成了临床实验，因此，对血红蛋白的需求量将会愈来愈大。目前规模制备血 红蛋自的方法较多的采用了膜过滤或膜过滤与层析技术的组合1，一’」，但前者的选择性较差，后者 则增加了操作步骤，进而增加了成本和污染的机会，因此有必要开发新的大规模制备血红蛋白 的方法。扩张床吸附技术是一种能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品的下游 技术。它集固液分离、目标产品的初步纯化和浓缩为一体，兼有离心、微滤、吸附、超过滤等 功能，是一个过程集成的成功范例[61。本文将利用该技术对牛血红细胞破碎后形成的破碎液中的 血红蛋白进行纯化并与膜过滤一层析技术进行比较，以探讨该技术在规模制备血红蛋白方面的 可行性。 1材料与方法 1.1 肉牛全血从当地一家屠宰场采集 1.2 层析介质与设备 SPStreamline(AmetshamPharmaciaBiotech,UppslaSweden)，其配基为强阳离子交换基团丙磺 酸根 (Sulphopropyl,SP)。该介质的基质为大孔6%交联琼脂糖，内含结晶石英核，最大排阻分 子量4x106;球形，粒径分布为100一300p，平均粒径200p;平均顺粒密度约为1.2g/ml;在pH3 一11范围内稳定，清洗范围pH3一140 自制扩张床 ((26mmx400mm)由普通层析柱改造而成。 1.3 肉牛全血的采集与红细胞中Hb的释放 采集后的新鲜牛血装人含有NIH一AACD保存液的采血瓶中，轻轻摇动采血瓶使之充分混 合，然后于无菌条件下3000g,4%离心15一20min，弃去上清即血浆部分，下部压积的红细胞再 分别用等体积的1.6%NaCl和。.9%NaCl依次悬浮、离心即洗涤各两次即可得到沽净的细胞 (该 洗涤步骤只是在扩张床法与膜过滤一层析法比较时使用)，4℃保存备用。 血红蛋白的释放取一定体积的红细胞，按红细胞:蒸馏水=1:29(V/V)的比例混合，4% 冰箱中用磁力搅拌器缓慢搅拌30min，此时红细胞迅速溶胀以至破裂，血红蛋白完全释放出来。 1.4 扩张床吸附 研究表明，床层高度是介质堆积高度2倍左右时扩张床吸附的效果最好[71。因此在扩张床吸 附中采用2倍堆积高度 (即固定床高度)，流速为200ccn/h。该流速由流速一扩张床床高关系确 573 定 扩张床吸附过程分为介质平衡、床层平衡、进料吸附、淋洗、改变pH洗脱、高盐洗脱、介 质再生等步骤 1)介质平衡 在固定床状态下，用3倍柱体积平衡液 (l0mmol/LNa2HP04/NaH2P04溶液 (PBS),pH6.60)平衡介质; 2)}末层平衡 以200cm/1，的试流速将平衡液白下而I几打过床层 (该流速下扩张床体高度为 固定味高的2倍)，平衡液可循环使用。 3)进料吸附 扩张床层稳定20min后即可进料。用蠕动泵将L述的红细胞破碎液以相同的 流速自下而t进料。进料过程中注意观察床层L界面位置的变化情况，适当调节流速。保持床 层高度和空隙率