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细胞周期分析与凋亡检测 实验目的 观察和认识细胞凋亡的形态学特征，了解流式细胞仪的原理，学会流式细胞仪测 定结果的分析。 实验原理 流式细胞仪是一种可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选的大型仪器。 在分析和分选的过程中，被称为鞘液的液流包被单个细胞通过聚焦的光源，用各种光敏元件 测量其散射光、荧光等参数而达到测量其化学性质和物理性质的目的。 当液流中的细胞在激光照射激发下，就会向各个方向发出散射光和荧光，散射光又分为 前向散射（FCS）和侧向散射（SSC），由于使用染料的不同会有不同波长的荧光。选FL1、 FL2、FL3 等进行测量。计算机处理可输出单参数直方图、二维点图、等高图、三维图以及 一些统计结果。 细胞周期分析通常运用PI染色，活细胞需要添加透膜剂使染料进入细胞，根据细胞中 DNA 的含量做出荧光强度的图形，用于周期分析。 细胞凋亡分析一般采用FITC 标记的膜联蛋白（Annexin V）染色细胞。磷脂酰丝氨酸 （PS）通常只存在于质膜内侧，在细胞凋亡早期，细胞膜外翻，可被Annexin V—FITC 染 色，由于此时细胞膜仍未失去整合性，PI无法进入细胞。在细胞凋亡晚期，膜的整合性发 生改变，PI才能进入细胞染色。根据荧光颜色的不同，可被不同的检测器接收，进行荧光 分析。 TUNEL分析也是细胞凋亡分析的方法之一。 细胞周期分析和凋亡检测的染料通常也可以用于荧光显微镜的染色观察。 实验仪器和药品 荧光显微镜，流式细胞仪，溴化乙锭（EB）, 吖啶橙(AO)，Annexin V— FITC 试剂盒， 碘化丙锭（PI）。乙醇，冰醋酸等。 材料 培养在瓶中或盖玻片上经过药物或照射处理的动物细胞。 实验方法 1．将瓶中长有细胞的盖玻片取出，用卡诺固定液固定30分钟，凉干，用0.01%吖啶橙 染色15 分钟，蒸馏水冲洗，盖上盖玻片即可在荧光显微镜下观察。 2．将瓶中培养的贴壁细胞消化，加入PBS。悬浮细胞不需消化，转入离心管，2000转 /分钟离心8 分钟，弃上清，重复一次。加少许PBS，调整细胞密度为0.5×10—2×10 个细6 6 胞/ml，用1µl AO/EB 溶液（1 份PBS 中100µg/mlAO 溶液，1 份PBS 中100µg/mlEB 溶液）， 加25µl细胞悬液，轻轻混合，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。 3. 将瓶中培养的贴壁细胞消化，加PBS，转入离心管，2000 转/分钟离心8 分钟，弃上清， 重复一次，用乙醇固定，PBS清洗一次后，收集0.5×10—2.0×10/ml个细胞,加入5µg/mLPI6 6 染色30min，用FL2 进行测定。 4.将瓶中培养的细胞消化，加PBS，悬浮细胞不需消化，转入离心管，2000转/分钟离心8 分钟，弃上清，重复一次。收集0.5×10—2.0×10/ml个细胞，加入500µlBindingBuffer，6 6 加入5µl Annexin V—FITC，混匀，加入5µl PI，混匀，用（FL2或FL3）进行测定。 实验结果 用荧光显微镜观察时，吖啶橙染色的材料可看到细胞凋亡的不同时期和明显的凋亡小 体。AO/EB双染的片子需要马上进行观察，活细胞被染成均匀的绿色，早期凋亡细胞也呈绿 色，由于染色质凝聚及核裂解，细胞核中有绿色的斑点。凋亡晚期细胞和坏死细胞被AO染 成橙色，死细胞核形态完整，但凋亡晚期细胞的核凝聚并常常裂解。 胞数目多.在对细胞分裂G0/G1，S，G2/M期分析时，一定要与对照进行比较。 凋亡分析二维点图的3区是活细胞区，4区是早期凋亡区，2区是晚期和坏死细胞区。 根据这些分析，可对早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞或死细胞有一个定量的分析。