东方巴贝斯虫的分子生物学分类的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代裹大会暨第八次学术研讨会论文集 原虫部分 东方巴贝斯虫的分子生物学分类研究 刘琴“2付媛。2周艳琴2周丹娜“2江涛“2王金苹“2赵俊龙“2姚宝安 (1华中农业大学农业微生物国家重点实验室，湖北武汉，430070) (2华中农业大学动物医学院，湖北武汉，430070) 摘要：对水牛巳贝斯虫病的研究表明，该病病原在形态学、传播者、致病性等多方面都与其 它种巴贝斯虫不同，因此被命名为新种一一东方巴贝斯虫(历besiaorienta』，曲。为了进一步证实 这一分类的可靠性，本研究对该病原进行了分子分类学研究。利用真核生物18srRNA基因的PeR 通用引物对谊虫种基因组DNA进4-i-扩增，得到东方巴贝斯虫的lgsrRNA全基因片断，测序后blast 5种已知巴贝斯虫 分析表明该虫种属巴贝斯虫无疑．将谊基因1700bp长片断序列与GenBank中1 的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，东方巴贝斯虫与南非未定种的巴贝斯虫 亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远．这 一结果说明水牛巴贝斯虫病的病原确实是一新种，我们过去否定水牛巴贝斯虫病是由牛巴贝斯虫 与双芽巴贝斯虫混合感染的判断是正确的． rRNA；新种 关键词：东方巴贝斯虫；水牛；PCR；18s 水牛巴贝斯虫病是经蜱传播的重要血液原虫病。在我国长江以南许多省份发生和流行“’“。 临床上以患病牛高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征，常引起死亡，造成重大的经济损失”’。 近年来我们对该病的流行病学、传播媒介、药物防治和免疫学等方面进行了研究，发现该病病原 在形态学、传播者、致病性等多方面都与牛方巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫不同，因此将其确定为新 orJenmlis)“’…。为了进一步证实这一分类的可靠性，本 种并命名为东方巴贝斯虫(Babesia 试验对该病原进行了分子分类学研究。 1材料和方法 1，1试验动物：自水牛巴贝斯虫病非疫区购回一岁左右水牛犊，使用前30d左右手术除脾，耳 静脉涂片姬姆萨染色无血液原虫寄生，乳胶凝集试验证实抗东方巴贝斯虫抗体阴性【61，在无蜱 的条件下饲养。 1．2染虫红细胞：从水牛巴贝斯虫病疫区采集刚上牛身的饥饿镰形扇头蜱成蜱，置于供试牛的 耳壳内(每头牛50只左右)，罩上耳罩，让其自行叮咬．实验牛感染镰形扇头蜱后每天耳静 脉采血，姬姆萨染色镜检计算红细胞染虫率，当试验牛染虫率升至1％以上时，颈静脉无菌采 存于液氮中备用。 1．3基因组DNA纯化：将200uj37℃融化的冰冻的东方巴贝斯虫染虫红细胞加入到1,Sml聚丙 基金项目：国家自然科学基金资助 作者简介：刘琴，女，1980年生，硕士研究生，主要从事寄生虫分子生物学研究 hzau．cdu．crl 通讯作者：赵俊龙，cmail：zlmojunlong@mml 中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集 原虫部分 吸取上清于另一1．5ml聚丙烯离心管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)。混合5min， 干燥，加20一50F，TEbuffer或ddH20溶解，备用p’’。 1．4目标基因的PCR扩增：PCR扩增的目标基因为18srRNA基因，根据GenBank中巴 贝斯虫18srRNA全基因序列设计扩增水牛巴贝斯虫18srRNA全基因的通用引物，该引物序列为： 31个循环周期Ilo】。PCR产物在含有溴化乙锭的0．8％琼脂糖上电泳，检测其纯度与大小。 1．5PCR产物纯化及克隆：按上海生工PCR产物回收试剂盒说明书操作回收目的DNA片段， 连接到PMDl8．T载体上，转化大肠杆菌DHs。，酶切鉴定，筛选到5个阳性克隆子，送上 海生工科技有限公司按Sanger’s双脱氧链终止法进行核酸序列测定。 1．6序列分析与系统发生树的建立：将测定的东方巴贝斯虫18srRNA基因序列与基因库 (GenBank)中未定种巴贝斯虫