BYDV-GAV运动蛋白的表达、纯化、抗血清制备和检测.pdfVIP

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2017-08-13 发布于未知
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BYDV-GAV运动蛋白的表达、纯化、抗血清制备和检测.pdf

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病毒及病毒病害 v-GAV运动蛋白的表达、纯化、抗血清制备与检测谢家建，王锡锋，刘艳，彭于发，周广和 (中国农业科学院植物保护研究所植物病虫专生物学国家重点实验室，北ft．100094) 运动蛋白(MP)是病毒基因编码的，介导病毒在宿主细胞间运动非常重要的蛋白。对MP蛋白定量和在植株体内进行跟踪研究是研究其功能的重要基础。而MP蛋白在发病植株体内含量很低，很难得获得纯化的MP蛋白。本研究将BYDV-GAV 蛋白，采用Ni柱进行亲和纯化，获得纯化的MP融合蛋白。免疫小鼠制备了抗MP血清。抗血清效价为l： 10000，并在接种发病植株中检测到MP蛋白，其含量为0．5．1岖胞鲜重叶片。 1 MP基因的克隆和表达载体的构建 (下划线为NdeI 和 MP2： 5-GA!坠蟹幽三GCCa认GGAGAGCAAGG．3‘ 酶切位点) kDa，表达的融合蛋白是在完整的MP 的MP基因全长为462bp，编码154个氨基酸，理论分子量为17．2 子量为19．7kDa。 2 MP融合蛋白的表达和纯化分别接种鉴定阳性的单菌落于4mL的含100 extract，and 1．0％NaCl，pH7．O)中。37℃培养8．12 达带，而空载体和未诱导的阳性克隆则没有(Fig．1)，将表达量高的单菌落用于大量表达。 1L含100 mM的IPTG I．tg／mL氨卞的LB液体培养基中。37℃培养使OD600达到约0．6时，加入至终浓度0．4 Buffer 进行诱导，28℃诱导8hr。培养菌液12000 A(50raMsodium rpm离心20min，沉淀用50mL phosphate buffer pH7．4，500mMNaCI)悬浮。采用超声波破碎菌体，进行溶解性分析，结果表明表达的可溶性MP蛋用于表达蛋白的纯化。大量纯化时采用3种不同的溶液进行纯化，先分别采用不含咪唑和含lOOmM咪唑的BufferA洗脱杂．．215．．蛋h川信500mM的麟I啡沈脱Hn7』蛋亿透析后崔臼浓他删定为f)28 …』、约6 3J nag的MP·囊引蛋白tFig 计曲档刊一州；薹搿～罴善耄：呈一_萋～一曲时m 罴州 ofpositive 孵鲰嚣孵龃器虬虬 M。 l善- M‘molecular 2 MP如sion cells sonication．Lane wet曲t