HERG论文：盐酸昌欣沙星抑制HERG钾离子通道分子机制的研究.docVIP

HERG论文：盐酸昌欣沙星抑制HERG钾离子通道分子机制的研究 【中文摘要】HERG (human ether a-go-go related gene)基因最初发现于人脑的海马组织,编码延迟整流钾通道快速成分(rapid component of delayed rectifier potassium channel, IKr)的α亚基,其介导的HERG钾离子流(IHERG)在心肌动作电位复极化3期过程中发挥重要作用。研究表明,HERG突变是2型遗传性长QT综合征(long QT syndrome, LQT2)发病的分子生物学基础,而药物引起的HERG钾通道的阻断是获得性LQTS的主要原因。严重时二者均可引起心肌动作电位复极化时程延长,诱发心律失常,如尖端扭转型室性心动过速(Torsades de pointes, Tdp),以体表心电图QT间期延长,发作性晕厥或心源性猝死为典型临床症状。HERG钾通道能被多种药物阻断是由其特殊的分子结构决定的。HERG钾通道与其他钾通道相比,内腔较大,易被一些药物结合,且内腔中的一些氨基酸,如Tyr652, Phe656与多种药物高度亲和,抑制IHERG°目前已知能够通过阻断HERG钾离子通道引起LQTS的药物有心血管系统药物以及多种非心血管系统药物,如抗疟疾药、抗组胺类药、和抗肿瘤药、肌肉松弛剂,抗生素和抗菌剂等都可通过与HERG钾通道内腔氨基酸结合,不同程度地抑制IHERG,诱发心律失常。因此,近年来在新药研发过程中,药物对IHERG的阻断作用就成为药物研发过程中心脏安全评价的重要指标之一,精确理解药物阻断作用的分子机制则成为临床工作者和基础研究人员关注的焦点问题。氟喹诺酮类抗菌药是广泛用于感染性疾病的第三代喹诺酮类抗菌药。因其口服易吸收,抗菌活性强而在临床上广泛应用。然而,近年来随着这类药物临床应用面的扩大,因几种氟喹诺酮类抗菌药物抑制HERG而使心肌复极化3期时程延长,进而导致体表心电图QT间期延长,诱发获得性LQTS的报道不断公诸于世。例如,氟喹诺酮类药物的代表药物之一司帕沙星(Sparfloxacin, SPX)因相继在家兔和人,被发现可以显著引起QT间期延长,心肌细胞动作电位时程的延长,而被退出市场,因为相同的原因被撤出市场的还有格帕沙星(Grepafloxacin, GPX)、加替沙星(Gatifloxacin, GTX)、替马沙星(Temaflloxacin, TMX)。盐酸昌欣沙星(Chinfloxacin, CFX)是我国自主创新、开发研制的第三代氟喹诺酮类抗菌药,其对IHERG的作用尚不清楚。因此本文的问题是：CFX,是否与其他氟喹诺酮类药物一样,对IHERG有抑制作用,如果CFX能够抑制IHERG,那么CFX与HERG钾通道相互作用的分子机制是什么?本课题通过下述三个部分回答这些问题：首先以体外瞬时表达HERG钾离子通道的HEK293细胞为研究对象,利用全细胞膜片钳记录技术,观察CFX对HERG钾离子通道的影响,并以CFX的改造前体,目前正广泛应用于临床的盐酸莫西沙星(Moxifloxacin, MOX)为阳性对照。结果显示CFX以浓度、电压和时间依赖的方式抑制IHERG,且主要作用于通道的开放状态。但是CFX抑制HERG尾电流的半有效浓度(IC50=162.1μM)是其修饰前体MOX (IC50=62.5μM)的约两倍,这表明与MOX相比,CFX对IHERG的抑制作用减小,即心脏毒性减弱。药物引起LQTS的因素很复杂,除了药物作用于通道本身外,当病人患有代谢性疾病、电解质紊乱等,均可以增加患者对药物的敏感性,使药物诱发LQTS的可能性增加。本实验中也观察到,当细胞外液钾离子浓度无论增高或降低时,与正常细胞外液相比,同一浓度的CFX对IHERG显示更强的抑制作用,这提示胞外钾离子浓度异常可增加通道对药物的敏感性。其次为了研究药物与通道蛋白之间相互作用的分子机制,本课题采用了计算模拟的方法对HERG钾离子通道蛋白进行同源蛋白三维结构建模以及与药物小分子进行分子对接,研究CFX与HERG钾通道蛋白结合的分子机制。结果显示：新型氟喹诺酮类抗菌药CFX与HERG蛋白相互作用的主要氨基酸位点有Tyr652,Ser624,Phe656和Gly648,以与Ser624的羟基氧之间的氢键作用最强。最后,用分子生物学实验的方法把与CFX相互作用较强的几个氨基酸位点突变后,观察CFX对这些突变体的影响,实验结果显示除了突变体G648A的电流记录不到以外,500μM CFX对突变体Y652A、S624A、和F656C的抑制作用与野生型相比,抑制率分别减少了20%、50%和40%。这说明CFX与HERG通道相互作用的结合位点主要集中在这几个氨基酸上,尤以与S624位点的作用最强。因此在今