SPA的纯化、表达与鉴定.docVIP

SPA的纯化、表达与鉴定 中文摘要： 该实验用大肠杆菌做表达载体，然后用IPTG诱导大肠杆菌表达SPA，破碎大肠杆菌提取SPA后用镍柱纯化，再运用SDS、双向免疫扩散法、western blotting等方法对表达的蛋白质进行鉴定，其中制备免疫血清（抗SPA免疫血清）选取的动物为雄性健康成年的家兔。 中文关键词：SPA、SDS、western blotting、双向免疫扩散。 前言 1. SPA的背景 SPA即(Staphylococcal protein A,SPA)葡萄球菌A蛋白，是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白(单链多肽),能与人及某些哺乳类动物的IgG分子的Fc段发生非特异性结合,SPA与IgG结合后的复合物具有抗吞噬,促细胞分裂,致超敏反应和损伤血小板等活性.（）SPA SPA存在于大多数（90）SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（methicillin-resistant strain）SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。 （）SPA SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其相对分子质量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热抽提法，所测相对分子质量为12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol／L鸟嘌呤盐酸中凝胶过滤，测出相对分子质量为42000。SPA为单链多肽，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA黏度高于球蛋白，等电点（pi）5．1，其天然结构十分稳定，在应用6 mol／L鸟嘌呤盐酸变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。 （）SPA ???SPA具有和人及许多动物（）IgGSPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合2个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物[如荧光素、酶（HRPAKP和GO等）]相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，与SPA结合后IgG可用4mol／L鸟嘌呤盐酸等使之解离。利用这一生物化学特性，可以将SPA交联在葡聚糖凝胶上，对抗原或抗体蛋白质进行纯化。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型IgGl、IgGz和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3；只结合IgH2，而不结合IgHl。SPA与人及大部分哺乳动物血清中的IgG结合，能反应的动物包括豚鼠、小鼠（）CH2和Cn3的交界处。另外，它还能与少数血清中的IgM结合。SPA还能激活和固定补体，激活B淋巴细胞，促使其成熟并分泌产生各类免疫球蛋白。 （）1．免疫原性与过敏原性SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。 　　2．抗吞噬作用由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。 　　3．固定补体SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。 　　4．促有丝分裂因子SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。 5．去封闭作用固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。　 2．应用于免疫细胞化学：由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半。SPA分子量小（13000～42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。 3．应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型。 4．可作为一种研究