文昌鱼基因组BAC文库构建.pdfVIP

疆建In 第三届海洋生物高技术论霞 200s．08．19．23 文昌鱼基因组BAC文库的构建+ 王蔚Ⅲ一，徐怀亮②，宿兵②，王义权①，+ ①厦门大学生命科学学院，厦门361005； ②中科院昆明动物研究所细胞与分子进化重点实验室，昆明650223 摘要：文昌鱼在脊椎动物起源与进化研究中占居重要地位。尽管国外已构建了佛罗里达文昌 鱼的BAC文库，考虑到我幽产的白氏文昌鱼与该物种有较大的遗传差异，我们构建了产自 个克隆经NotI酶切和脉冲场电泳分析结果表明，文库的平均插入片段大小120kb，以文昌 鱼基因组大小为400Mb计算，文库的覆盖度达12X，理论上从该文库中筛得任何一个文昌 鱼的基因或基斟片段的概率为99．9995％。因此，该文库是文昌鱼和比较与功能基冈组研究的 重要资源之一。 关键词：文昌鱼；基闪组；BAC文库 继2001年人类基测组序列框架图完成以来，去年10月国际人类基冈组测序联盟(IHGSC) 又宣称完成了人类基闪组常染色质IX的测序【l】，冷泉港科学家Stein为此发表点评，认为人类 基|大|组计划的下一个主要T作任务之一是通过比较人与动物的基因组，发掘基因组中新的功 中最近似1：脊椎动物弧门Ve】tebrata赢接祖先的一个类群，在动物进化史上占据极其重要的 地位，其单倍基因组仪400Mb左右，是人类基因组的1／6【3】。文昌鱼基因组呈现基因大规模 倍增前脊椎动物祖先的基因组特征【4，引，是研究脊椎动物基I列组起源和进化、基因倍增和基凶 家族演化、新基I大J产生和基【大|退化等问题的重要比较素材。高质量的基闪组文库是文昌鱼基 岗组研究，特别是大范围的基I大】、基因簇比较研究和全基因组测序T作的基础。近日我们完 成了中国厦门产文吕鱼Branchiostoma 个克隆，平均插入片段约120kb，相当J二文吕鱼基因组的12倍，为比较基因组研究提供了 宝贵资源。 l材料与方法 1．1高分子量基因组DNA提取和大片段DNA制备 文吕鱼Branchiostomabeheri采自厦门海滨。实验室内用液氮将活标本迅速冷冻，在液 氮中研磨成粉，于DNA提取缓冲液中用匀浆器匀浆，然后反复过滤、洗涤数次以收获单细 胞，冉将细胞悬液调节至5x108cell／ml，与1％琼脂糖(BioWhittakerMolecular Applications)毛E 启动皋金和中国科学院昆明动物研究所细胞。j分子进化晕点实验室开放基金资助。 ’通讯联系人Email：wangyq@xmu．edu．crl。 610 福建囊门 第三届海洋生物高技术论坛 2005．0819．23 45。C下混合后，制成琼脂糖凝胶块，然后于50。C消化缓冲液中蛋白酶K原位消化包埋于琼 脂块中的细胞30 小片段DNA，取出留有大片段的包埋块，再用髓DR Co．)和M．艮棵I I限制性内切酶(NEB 甲基化酶(NEBCo．)竞争性酶切，酶切完成后用含20％NDS的缓冲液终止反应，酶切后的琼 脂糖凝胶块经连续两步脉冲场电泳分离DNA，以LowPFGmarkers(New Range England Biolabs)为分子餐标记，14℃下以6V／cm电压电泳15h，切下150～200kb的DNA压缩带， 将切下的凝胶块装入大小合适的透析袋(Life 0．5X的TBE，以 Technologies)中，加入400Ixl 3V／cm的电压，电洗脱2h，同收DNA。至此，得到所需大片段基因组DNA。 1．2大片段DNA的连接与转化 u1反应体积 收集透