液相色谱和核磁共振谱(LC-NMR)联用技术在药物研究中的应用.pdf

液相色谱与核磁共振谱(Lc—NMR)联用技术在药物研究中的应用 目前，HPLC技术日益成熟，已能够分离非常复杂的混合物，是现代药物分析中不可缺少的分离手段。 在HPLC中广泛应用的uv可变波长检测器，可获得一些被检测化合物的附加结构信息，但非常有限，对解 析未知化合物的结构常常无能为力，因此还需要一些与其相关的结构信息更为丰富的检测技术如IR、MS、 NMR等。其中NMR能够提供丰富的化合物结构信息，包括立体化学信息(区分结构、构型及光学异构体方 面)，是确证未知化合物结构的最有力的波谱技术之一。在已知分子量、待检测未知物较纯的条件下，被分析 物的结构通常可以通过NMR谱直接确定，然而对于复杂的混合物，由于各组分的NMR信号相互覆盖、影 响，单纯靠NMR谱同样无能为力，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪相结合并且日益普及的原因。 比较成熟的分析手段。 1 HPLC—NMR联用技术 当时NMR仪的灵敏度较低，溶剂峰抑制问题也尚未解决。经过80年代和90'年代的发展，特别是新千年以 了动态变化、灵敏度及溶剂抑制的问题，从而使HPLC—NMR联用技术得到了迅速发展，应用也日益广泛。 1．1 HPLC—NMR仪器的设计 HPLC—NMR联用仪系统一般由图1所示的各部分组成。液相色谱仪分离样品中各组分，起着样品制 和NMR仪进行数据采集和处理，是HPLC—NMR的中央控制单元。 垂# 图1 LC—NMR仪器结构图 1．2 HPLC—NMR探头的设计 一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成，它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3 定体中心有—个玻管可加入氘代试剂，以确保用非氘代洗脱液时锁场的稳定。由于射频线圈直接固定在检 factor)接近最佳值，这种类型 测池的玻璃管上，NMR线圈的体积与试样体积比，即所谓的填充因子(filling 的NMR测定探头原则上是最灵敏的，测定时不用旋转。 934 一NMR探头得到了发展。一种设计是在体积为数nL的检测池外固定NMR微线圈，还有一种设计是将毛 的好处在于更换检测毛细管简便易行。更进一步的改进是将填充毛细管分离柱置于磁体的正下方，通过传 于200nL。最新的微探头设计为用氢氟酸冲洗毛细管内壁并加热检测窗，形成类似气泡的检测池，检测体积 在240--400nL。 综上所述，流动池探头是HPLC—NMR最关键的部分，要求能提供最佳的灵敏度、线形并使色谱峰分离 失真最小。探头的重要参数是其直径和体积，取决于所希望的样品量LC峰面积。 1．3溶剂峰抑制方法 大多数HPLC体系采用反相柱，使用2种或以上溶剂的混合液作洗脱液，除D20外，其他洗脱液如使用 氘代溶剂作为常规使用，价格过于昂贵。因此，I-LPLC—NMR实验中常采用含质子的溶剂，如乙腈、甲醇等。 为了消除NMR仪接收器的动态范围问题(dynamicrange problem)产生的溶剂质子信号必须加以抑制。常 的发展，使溶剂的消耗量大大减少，有可能在实验中完全使用氘代试剂作洗脱液，可不必使用溶剂抑制。 1．4测定方法 目前测定方法分为3种，即连续流动测定法、停流测定法和峰存储测定法。连续流动测定法是在液相色 移值与LC峰保留时间作图的二维堆栈图，可以确证化合物。但要确证未知化合物的结构，需知道除1H— NMR以外的其他更多的信息，采用停流测定法可以满足这些要求，即当HPLC分离的色谱峰到达探头时， 通过计算机程序使流动相停止流动，可长时间获得一维或多维谱；这种方法需尽量减少流动池中的扩散现 象，以避免在色谱柱中已分离的色谱峰由于自身扩散而变宽，如这些色谱峰也需测定，可贮存于样品杯内，重 复上述步骤，即可完成对各色谱峰的测定。峰存储测定法是指色谱洗脱在lO～30s的短时间间隔内在每个 时间点采集NMR数据。这种测定方法用于获得单个色谱峰的几个不同时间点的NMR谱可以进行峰纯度 检查。这在新药研究中非常有用。 2在药物研究中的应用 HPLC—NMR技术在药物研究中的应用主要是在植物提取物中具生理活性化合物的结构鉴定、新药杂 质(glJ反应产物与降解产物)的结构鉴定、药物构型研究、药物代谢产物的结构及药代动力学研究，以及微生 物代谢物研究等项目中应用。 2．1天然药物研究