定量PCR的研究进展.pdfVIP

国外医学临床生物化学与检验学分册2004 年 1月第25 卷第 1期　Foreign Medical Sciences. Section of Clin Biochem Lab Med J, anuary 2004 ,Vol 25 ,No. 1 ·23 · ·综述 · 定量 PCR 的研究进展 梅英 综述 　刘长安 　龚建平 审校 　　【摘要】　定量 PCR 技术是在 PCR 定性技术基础上发展起来的基因定量技术 ,克服了原有 的 PCR 技术存在的不足 ,能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等 。本文就定量 PCR 技 术中的竟争性 PCR 和荧光定量 PCR 技术作一综述 , 以便更好地理解及应用这项技术 。 【关键词】　定量 PCR ; 　荧光 PCR ( ) 　　聚合酶链反应 polymerase chain reaction , PCR 测模板进行精确定量 。具体检测方法是将已知浓度 技术是 1985 年问世的一项基因检测技术 。由于 PCR 的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因 简便易行 、灵敏度高等优点 ,该技术被广泛应用于基 一起扩增 , 以参照模板的起始拷贝数为横轴 , 以两模 础研究 。但是 , 由于传统的 PCR 技术不能准确定量 , 板扩增产物量的比率为纵轴 ,作出标准曲线 ,纵坐标 且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点 ,使其 为 1 的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测 在临床上的应用受到限制[ 1 ] 。鉴于此 ,对 PCR 产物 基因的拷贝数 。由上述定量原理可知 ,保持两模板扩 进行准确定量便成为迫切的需要 。几经探索 ,先后出 增效率 E 的一致性是定量的关键 ,为此要求参照模板 现了多种定量 PCR (quantit ative PCR ,QPCR) 方法 , 应与待测基因具有相似的大小及序列 ,相同的引物结 其中结果较为可靠的是竞争性 PCR 和荧光定量 PCR 合位点 。此外 , 参照模板还应在扩增后易于分离检 (fluorescence quantit ative PCR , FQPCR) 。本文就这 测 。因此 ,对于竞争性 PCR 的研究重点主要集中在 两种定量 PCR 技术作如下综述 。 建立高效 、稳定 、可靠的模板方面 ,现已取得了较满意 的结果[3～5 ] 。 竞争性 PCR 荧光定量 PCR 定量 PCR 技术是对传统 PCR 技术的进一步发 展和补充 ,在定量过程中需借助各种形式的参照物 。 荧光定量 PCR 是近年来新出现的 PCR 定量技 ( 参照物是一种已知含量的标准模板 ,按其是否与待测 术 ,该技术是建立在荧光能量传递技术 fluorescence 样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照 。 resonance energy t ransfer ,FR E T) 的基础之上 。FR E T 鉴于 PCR 扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差 是指通过供 、受体发色团之间偶极偶极相互作用 ,能 异 ,理想的定量 PCR 应该使用内参照 。竞争性 PCR 量从供体发色团转移至受体发色团 ,转移效率与两个 即是采用内参照的一种定量 PCR 方法 ,通过消除管 发色团之间距离的 6 次幂倒数成正比。以下是 目前 间及样 品间的变异 , 从而达到较为精确 的基