白色念珠菌总RNA的提取方法.pdfVIP

维普资讯 第 33卷 第 2期 吉 林 大 学 学 报 (医 学 版 ) Vo1．33 No．2 ‘2007年 3月 JournalofJilinUniversity(MedicineEdition) M ar．2007 359 [文章编号] 1671—587X(2007)02—0359—03 白色念珠菌总RNA的提取方法 IsolationmethodoftotalRNA from CandidaAlbicans 张云峰 ，焦立新 。，贺 丹 ，宋文刚 ，孙文通 ，横 山耕治 ，王 丽 (1．吉林大学基础医学院病原生物学教研室，吉林 长春 130021；2．吉林大学第一医院儿科，吉林 长春 130021； 3．吉林省长春市中心血站中心实验室，吉林 长春 130033；4．日本 国立千叶大学真菌医学研究中心，日本 千叶 亍 260—8673) [摘 要] 目的：探讨提取 白色念珠菌总RNA的方法。方法：白色念珠菌标准菌株经 SDA培养基培养后 ，采 用改 良的异硫氰酸胍一步法提取总 RNA。以此为基础 ，进行反转录 PCR反应 。结果：得到的RNA经过紫外分 光光度计检测浓度达到 0．7g ·L 以上 ；琼脂糖凝胶电泳证实为完整 、均一的总 RNA；将此法提取的 RNA反 转录成 eDNA后经过 PCR扩增 ，可获得清晰的 目的条带。结论 ：该方法简便、快速 ，提取的总 RNA可 以用于 进一步基 因克隆、表达 。 [关键词] 念珠菌，白色；聚合酶链反应；RNA提取；异硫氰酸胍法 [中图分类号] R379．4 [文献标识码] A RNA提取是进行 白色念珠菌基 因的克隆、表 珠 ，RNA 逆转 录试剂盒 (TaKaRa，RNA PCR 达重要的基本操作之一 。目前 已经建立 了许多从动 KIT Ver．3．0)。 植物细胞 中提取 RNA 的方法 ，常用的有 Trizol试 1．2 仪 器 超声波细胞粉碎机 (宁波薪芝生物 剂快速提取法 、异硫氰酸胍法、Cs梯度离心法、 科技有 限公司)，低速台式离心机 (TDL-40B型， 苯酚法等L1]。而从真菌尤其是 白色念珠菌 中提取 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 )，低 温 高 速 离 心 机 RNA的方法报道较少，且步骤较繁琐、耗费时间。 (Heracus，德国)，紫外分光光度计 (Spectrumlab 本研究参照 已有 的异硫氰酸胍提取 RNA法口]， 52型，上海梭光技术有限公司)，PCR仪 (PC320 经过改 良用于酵母相 白色念珠菌总 RNA提取 。该 型 ，美国)。 方法操作简便，耗时较短，RNA降解少，纯度高， 1．3 白色念珠茵细胞破壁方法 ① 超声波细胞破 能够满足下一步分子生物学实验的需要。 壁法：将 白色念珠菌接种 于 SDA 培养基，培养 2～3d，从平板上直接收获菌体，加 2倍体积的 1 材料与方法 7596／乙醇灭活 1～2d。2000r·min-1离心 10min， 1．1 茵株及试剂 白色念珠菌标准菌株 ATCC 灭菌蒸馏水洗涤，称取菌体 100mg于 15mL的聚 90028，日本国立千叶大学真菌医学研究中心赠送 ， 丙烯试管 中，加入 2mLDEPC水 ，将离心管置于 常规保存 ，定期传种。采用 SDA培养基 。变性液 冰上 ，超声波处理 5min (参数设置 ：工作 1S，间 (4otol·L 硫氰酸胍 ，25mmo|·L 柠檬酸钠， 停 2S，预置功率 比509，6，槽温度 50℃)，成匀浆 0．1otol ·L 二 巯 基 乙醇 ，0．5 Sarkosy1)， 状 。提取过程严格遵守提取 RNA 的规则，防止 2otol·L 醋酸钠 (在 40mL水和 35mL冰醋酸 中 RNA酶的污染 。②玻璃珠细胞破壁法 ：白色念珠