人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)酶联免疫分析.pdfVIP

人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）酶联免疫分析ELISA试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中t-PA含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中t-PA水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗 体， 往包被单抗的微孔中依次加入t-PA抗原、生物素化的抗人t-PA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤 后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色 的深浅和样品中的t-PA呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板：一块（96孔） 2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠 倒/搓动以助溶解，其浓度为10000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成 10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250pg/mL，625pg/mL，312pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直 接作为标准浓度0pg/mL，临用前15分钟内配制。 如配制5000 pg/mL标准品：取0.5ml10000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管 中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。 4. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。 5. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。 6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100 稀释，稀释前根据预先计算好的每次 实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释 液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。 标本的采集及保存 1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。 2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放 于-20℃保存，但应避免反复冻融。 3．血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000 xg离心15 分钟，或将标 本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意 不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。 2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。 3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。 5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色， 后3-4孔梯度不明显）。 6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光 密度（OD值）。 注： 1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用 此孔调OD值至零。 2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下 用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的人t-PA，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线， 根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准 曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实 际浓度。 注意事项 1